Введение
1. Структурно-генетические исследования рнк-полимеразы 8
1. Структурно-генетический подход.Краткие сведения 8
2. Структурно-генетические исследования гроБС оперона Escherichia coli 10
A. Локализация и исследование организации гроВС оперона 10
B. Исследование взаимодействия РНК-полимеразнЕ.соїі с антибиотиками и вирусными белками, инактивирующими фермент 15
1. Взаимодействие с рифампицином 15
2. Взаимодействие со стрептолидигином 20
3. Взаимодействие с липиармицином и тиолутином 22
4. Взаимодействие с белком гена 2 бактериофага Т7 24
C. Структурно-генетические исследования взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с компонентами реакции транскрипции на разных этапах процесса in vitro 25
1. Основные этапы процесса транскрипции. Краткие сведения 25
2. Исследование взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами 27
3. Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции 29
4. Структурно-генетические исследования процесса терминации транскрипции 31
5. Структурно-генетические исследования механизмов регуляции транскрипции 31
A. Взаимодействие РНК-полимеразы с белкамирегуляторами 31
B. Координация процессов транскрипции и трансляции 35
C. Координация процессов транскрипции и репликации 39
2. Структура некоторых мутантних генов rpob, escherichia coli, кодйрущих я -субъвдинщу рнк-полимеразы 41
A. Получение и селекция мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам рифампицину и стрептолидигину в составе гена rpoB 43
B. Препаративное выделение фрагментов гена rpoB мутантного типа 46
C. Установление первичной структуры фрагментов гена rpoB мутантного типа 48
1) Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена rpoB, несущих мутации гроВ1001 , гроВ1016 и гроБ1017 49
2) Установление первичной структуры EcoRI-G фрагмента, несущего мутацию гроВ1019 53
3) Определение первичной структуры .EooRI-C фрагмента гена rpoB, несущего stl-r мутацию гроВЮ18 57
Д. Локализация мутаций. Анализ характера локализованных замен 60
1) Локализация и анализ расположения и характера мутаций рифампицин-устойчивости 60
2) Локализация мутации устойчивости РНК-по-лимеразы к антибиотику стрептолидигину 70
Е. Локализация функционально важных участков в составе в -субъединицы РНК-полимеразы Е. coli 71
3. Экспериментальная часть 79
1. Материалы 79
A. Реактивы 79
B. Ферменты 79
C. Генетические материалы 80
Д. Растворы 80
1. Буферные растворы 80
2. Среды и сопутствующие растворы 81
3. Растворы для выделения плазмид 82
4. Растворы с красителями 82
5. Растворы для проведения химической модификации 83
6. Растворы для метода терминирующих аналогов трифосфатов 83
7. Смеси для приготовления ПААГ 84
8. Фотографические растворы и материалы 85
9. Оборудование 86
10. Методы 86
1) Приготовление гелей. Электрофорез 86
A. Заливка ПААГ. Условия электрофореза в ПААГ 86
B. Приготовление агарозных гелей. Условия электрофореза 87
2) Выращивание клеток рекомбинантных штаммов 88
3) Выделение плазмидной ДТЖ 88
4) Выделение фрагментов ДНК из рекомбинантных плазмид 90
5) Обработка ДНК по методу Максама-Гилберта 91
A. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 91
B. Введение концевой радиоактивной метки 92
C. Выделение меченых фрагментов ДНК 93
Д. Получение полинуклеотидов, меченных по одному концу 94
Е. Специфическая химическая деградация ДНК 95
Р. Электрофорез в структурных ПААГ 96
6) Определение первичной структуры ДНК методом терминирующих аналогов трифосфатов 97
A. Приготовление вектора 97
B. Приготовление гидролизата ДНК 97
C. Лигирование 98
Д. Трансфекция компетентных клеток 99
Е. Идентификация рекомбинантных клонов 100
Р. Наращивание фага и выделение фаговой ДНК 100
G. Идентификация клонированных фрагментов ДНК 101
Н. Проведение реакций 101
Выводы 103
