Введение
1. Введение 5
2. Литературный обзор 6
2.1. Классификация нейротоксинов пауков 6
2.2. Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла 7
2.3. Нейротоксины пауков, действующие на калиевые каналы 9
2.3.1 Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata 9
2.3.2. Нейротоксины из яда паука Heteropoda venatoria 11
2.3.3. Нейротоксины из яда паука Phrixotrichus auratus 11
2.3.4. Нейротоксины из яда паука Heteroscodra maculata 12
2.3.5. Нейротоксины из яда паука Stromatopelma calceata 13
2.3.6. Нейротоксины из яда паука Scodra griseipes 14
2.3.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria negriventer 15
2.4. Нейротоксины пауков, действующие на натриевые каналы 15
2.4.1. Нейротоксины из яда паука Atrax robustus 16
2.4.2. Нейротоксины из ядов пауков рода Hadronyche 17
2.4.3. Нейротоксины из яда паука Missulena bradleyi 19
2.4.4. Нейротоксины из яда паука Agelcnopsis aperta 20
2.4.5. Нейротоксины из яда паука Hololena curia 21
2.4.6. Нейротоксины из яда паука Paracoelotes luctuosus 22
2.4.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer. 22
2.4.8. Нейротоксины из яда паука Selenocosmia huwena 24
2.4.9. Нейротоксины из яда Selenocosmia hainana 25
2.4.10. Нейротоксины из яда паука Thrixopelma pruriens 26
2.5. Нейротоксины пауков, действующие на кальциевые каналы 28
2.5.1. Нейротоксины из яда паука Agelcnopsis aperta 28
2.5.1.1. со-Агатоксииы первой группы (ы-Aga I) 28
2.5.1.2. со-Агатоксины второй группы (ы-Aga-Il) 30
2.5.1.3. о-Агатоксины третьей группы (co-Aga-III) 31
2.5.1.4. (о-Агатоксины четвертой группы (o-Aga-IV) 32
2.5.2. Нейротоксины из ядов пауков родов Hadronyche и Atrax 33
2.5.3. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer. 35
2.5.4. Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata 37
2.5.5. Нейротоксины из яда паука Hysterocrates gigas 38
2.5.6. Нейротоксины из яда паука Segestria florentina 39
2.5.7. Нейротоксины из яда паука Filtstata Mbernalis 40
3. Результаты и обсуждения 44
3.1. Выделение нейротоксина lsp-і из яда паука lycosa sp 44
3.2. Биологические свойства нейротоксина lsp-і из яда паука lycosa sp. 46
3.3. Установление полной аминокислотной последовательности токсина lsp-1 50
3.4. Поиск гомологии с известными токсинами елокаторами ионных каналов 51
3.5. Получение рекомбинантного белка LSP-1 52
3.5.1. Конструирование вектора pET32b-Lsp-l и оптимизация условий экспрессии гибридного рекомбинантного белка Тгх-Lsp-l в кістках Е. colt 52
3.5.2. Получение рекомбинантного токсина Lsp-і из состава химерного белка Тгх-Lsp-1 55
3.6. Токсиномика яда паука agelena orientaus 57
3.6.1. Создание библиотеки пуклеотидных последовательностей кДНК. 57
3.6.2. Анапа библиотек нукчеотидных последовательностей кДНК паука Agelena orientalis 58
3.6.3. Исследование базы данных EST последовательностей A. orientalis с помощью структурных мотивов 60
3.6.4. Сравнение двух подходов анализа банка EST A. orientalis 70
4 Экспериментальная часть 73
4.1. Оборудование и материалы 73
4.1.1. Оборудование 73
4.1.2. Реактивы и ферменты 74
4.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 74
4.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы 75
4.2. Методы 77
4.2.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии 77
4.2.2. Выделение активной фракции LS 78
4.2.3. Выделение токсинаLsp-І 79
4.2.4. Восстановление дисульфидных связей и модификация SH-групп остатков цистеина 79
4.2.5. Определение частичной N-концевой аминокислотной последовательности 80
4.2.6. Гидролиз природного токсина Lsp-І специфической эндперотеиназой Asp-N 80
4.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 80
4.2.8. Расщепление ДНК эпдонуклеазами рестрикции и очистка фрагментов ДНК из агарозного геля 81
4.2.9. Лигирование фрагментов кДНК в линеаризованный вектор 81
4.2.10. Получение и трансформация компетентных клеток Ecoli 81
4.2.10.1. Трансформация методом теплового шока 81
4.2.10.2. Трансформация методом электропорации 82
4.2.11. Скрининг колоний E.coli, содерлсащих рекомбинантные молекулы тазмидной ДНК, с помощью ПЦР 83
4.2.12. Выделение тазмидной ДНК 83
4.2.13. Компьютерный анализ пуклеотидных и белковых последовательностей 83
4.2.14. Функциональная экспрессия генов в кістках E.coli 84
4.2.14.1. Сборка гена зрелого токсина Lsp-І методом ПЦР 84
4.2.14.2. Получение конструкци для экспрессии гена токсина Lsp-І 84
4.2.14.3. Выделение гибридных рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии 85
4.2.14.4. Выделение рекомбинантных токсинов 86
4.2.15. SDS-электрофорез белков. 86
4.2.16. Определение концентрации белка 86
4.2.17. Определение количества белка в хроматографических фракциях по площади их пиков 87
4.2.18. Масс-спектрометриярекомбинантных токсинов 87
4.2.19. Компьютерный анализ электронных баз данных 87
Выводы 88
