Введение
Глава 1. Обзор литературы .13
1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila 13
1.1.1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila .15
1.1.2. Эффекторные белки L. pneumophila 18
1.2. Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов .24
1.3. Гликозилтрансферазы .30
1.4. Lgt – семейство цитотоксичных глюкозилтрансфераз L. pneumophila 33
1.5. Заключение .39
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы для синтеза и модификации ДНК .42
2.1.2. Общелабораторные реагенты 42
2.1.3. Питательные среды и вещества 44
2.1.4. Олигонуклеотиды...45
2.1.5. Радиоактивные материалы...45
2.1.6. Лабораторное оборудование 45
2.2. Методы .47
2.2.1. Культивирование микроорганизмов .47
2.2.2. Выделение ДНК 47
2.2.3. Постановка ПЦР 47
2.2.4. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК 53
2.2.5. Трансформация 57
2.2.6. Создание делеционных штаммов S. cerevisiae 58
2.2.7.Определение токсического фенотипа у дрожжей титрационным методом 62
2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков .62
2.2.9. Выделение фактора элонгации 1A из клеток S. cerevisiae .64
2.2.10. Экстракция белков из клеток S. cerevisiae 65
2.2.11. Получение поликлональных антител 65
2.2.12. Электрофорез в SDS полиакриламидном геле .66
2.2.13. Иммуноблоттинг .66
2.2.14. In vitro трансляция в системе S. cerevisiae 68
2.2.15. Определение ГТФазной активности 68
2.2.16. Реакция глюкозилирования 69
2.2.17. Статистическая обработка результатов 71
Глава 3. Результаты исследований 72
3.1. Глюкозилирующая активность Lgt1 в отношении нативного и обработанного трипсином белка EF1A S. cerevisiae 72
3.2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1A 76
3.3. Идентификация нового субстрата фермента Lgt1 – белка Hbs1 85
3.4. Подавление белкового синтеза ферментом Lgt1 и его мутантными формами в системе S. cerevisiae .89
3.5. Создание коллекций штаммов S. cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации 97
3.6. Токсическое действие Lgt1 в генетически-сконструированных штаммах S. cerevisiae 100
3.7. Заключение .106
Глава 4. Обсуждение результатов .108
Выводы .119
Список использованной литературы 120
