Введение
ГЛАВА 1. Некоторые сведения о сывороточном альбумине человека. строение, функции, связывающие центры 9
1.1. Какие белки называют альбуминами.. 10
1.2. Метаболизм и распределение альбумина 10
1.3. Распределение и циркуляция 11
1.4. Функции альбумина в организме 12
1.4.1. Поддержание онкотического давления плазмы 12
1.4.2. Связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов 14
1.4.3. Альбумин — участник окислительно-восстановительных реакций в организме 15
1.4.4. Пластическая функция альбумина 16
1.4.5. Регуляция гемостаза 16
1.4.6. Участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови 17
1.4.7. Регуляция апоптоза 17
1.5. Структура молекулы 17
1.5.1. Первичная последовательность 17
1.5.2. Вторичная структура. Домены 17
1.5.2.1. Распределение аминокислотных остатков и зарядов 19
1.5.3. Третичная структура 20
1.5.4. Связывающие центры альбумина 25
1.5.5. Классификация центров 25
1.5.5.1. Главные («лекарственные») центры 25
1.5.5.2. Центр связывания двухвалентных катионов 26
1.5.5.3. Тиоловая группа остатка Cys-34 28
1.5.5.4. Центры связывания неэстерифицированных жирных кислот 28
1.5.5.5. «Минорные» центры 28
1.5.5.6. Другие классификации центров 28
1.6. Влияние физико-химических факторов на свойства центров альбумина 31
1.6.1.1. рН 31
1.6.1.2. Повышение температуры 33
1.6.1.3. Концентрация неорганических солей 33
1.6.1.4. Связывание лигандов 34
1.7. Заключение по главе 1 36
ГЛАВА 2, Флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях 38
2.1. Изучение белков с помощью красителей (история вопроса). Флуоресцентный зонд К-35 39
2.2. Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА) 44
2.3. Флуоресцентный метод определения массовой концентрации альбумина 47
2.3.1. Методика определения 47
2.3.2. Правильность и воспроизводимость метода 48
2.3.3. Сравнение флуоресцентного метода и унифицированного метода с БКП 50
2.4. Наборы реактивов для флуоресцентного теста 52
2.4.1. Состав реактивов 52
2.4.2. Стабильность реактивов 52
2.5. Технология выполнения анализа 53
2.5.1. Калибровка анализатора 54
2.5.2. Измерение исследуемой пробы 56
2.5.2.1. Подготовка проб 56
2.5.2.2. Определение показателя «эффективная концентрация альбумина (ЭКА)» 57
2.5.2.3. Определение показателя «общая концентрация альбумина (ОКА)» 57
2.6. Флуоресцентный метод исследования свойств альбумина жидкостей глаза 57
2.7. Заключение по главе 2 59
ГЛАВА 3. Молекулярные механизмы чувствительности флуоресцентного метода исследования альбумина 60
3.1. Исследование связывания флуоресцентного зонда с макромолекулой с помощью безызлучательного переноса энергии возбуждения с флуоресцентной метки на зонд 61
3.1.1. Использование явления безызлучательного переноса энергии возбуждения между флуорофорами для исследования связывания зонда с белком 62
3.1.2. Изоиндольная флуоресцентная метка как донор энергии возбуждения 64
3.1.2.1. Реакция образования изоиндольной метки 65
3.1.2.2. Сохранность связывающих центров ЧСА после реакции с ОФА 66
3.1.2.3. Стабильность флуоресцентной метки 67
3.1.2.4. Доказательство тушения ортофталевого альдегида по механизму безызлучателыюго переноса энергии... 69
3.1.3. Определение параметров связывания К-35 с препаратами альбумина 71
3.1.3.1. Метод с использованием БПЭ 71
3.1.3.2. Метод равновесного диализа 75
3.2. Размер молекулы альбумина в растворе. Данные рассеяния нейтронов 77
3.3. Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35 80
3.3.1. «Лекарственный» центр 1 81
3.3.2. «Лекарственный» центр II 84
3.3.3. Центр связывания билирубина 87
3.3.4. Центр связывания двухвалентных катионов 89
3.3.5. Тиоловый центр Cys-34 90
3.3.6. Влияние лигандов на связывание К-35 с альбумином. Данные ультрафильтрации 90
3.3.7. Конкуренция или аллостерическое взаимодействие между центрами? 91
3.4. Обсуяедение результатов раздела 3.3 92
3.5. Длинноцелочечные жирные кислоты как регулятор доступности тиола остатка Cys-34. Конформационное сопряжение транспортной и аитиокислительной функций альбумина 98
3.6. Состояние каких центров альбумина отражает флуоресценция К-35? 101
3.7. Анализ гетерогенности альбуминовых центров с применением наносекуидной флуоресцентной спектроскопии 103
3.7.1. Метод изучения гетерогенного затухания флуоресценции в биологических образцах («метод амплитудного стандарта») 104
3.7.2. Выбор специальной среды (амплитудного стандарта) 106
3.7.3. Флуоресценция К-35 в растворителях. Возможные механизмы тушения 107
3.7.4. Затухание флуоресценции К-35 в альбумине. Спектр конформационных состояний центров альбумина по данным анализа затухания флуоресценции 108
3.7.5. Влияние физико-химических факторов на гетерогенность затухания К-35 из альбумина 111
3.7.5.1. Гетерогенность состояний альбуминовых центров в изолированном альбумине и в сыворотке крови человека 111
3.7.5.2. Влияние кислотности среды 112
3.7.5.3. Влияние неэстерифицированных жирных кислот 112
3.7.5.4. Затухание К-35 при изменении ионной силы раствора и в присутствии динамического тушителя флуоресценции 115
3.7.5.5. Тушение нитратом флуоресценции АНС в ЧСА 117
3.7.5.6. Влияние повышения температуры 117
3.8. Заключение по Главе 3 118
ГЛАВА 4. Информативность альбуминового флуоресцентного теста. клинические наблюдения 120
4.1. Обзор применения флуоресцентного теста 121
4.2. Изменение связывающих центров альбумина при психических заболеваниях 124
4.3. Применение флуоресцентного альбуминового теста в офтальмологии 125
4.4. Критические состояния. Новый подход к раннему прогнозу распространенного перитонита: данные многоцентрового исследования 127
ГЛАВА 5. Конформационные изменения связывающих центров альбумина как универсальная реакция на патологический процесс 130
Заключение . 138
Выводы 140
Приложение 142
