Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Регуляция роста и ремоделирования кровеносных сосудов 15
1.1.1 Клеточные компоненты сосудистой стенки 15
1.1.2 Механизмы формирования сосудов 17
1.1.3 Ветвление сосудов при ангиогенезе 20
1.1.4 Специализация клеток при ангиогенезе: tip и stalk фенотип 21
1.1.5 Филоподии и ламеллоподии определяют направление роста сосудов 25
1.1.6 Ангиогенные факторы роста 29
1.1.7 Хемокины и цитокины, их роль в процессах ангиогенеза 35
1.1.8 Роль интегринов в процессах ангиогенеза 47
1.1.9 Роль протеаз в процессах ангиогенеза 49
1.1.10 Эндогенные ингибиторы ангиогенеза 49
1.2 Навигационные рецепторы в нервной и сердечно-сосудистой системе 51
1.2.1 Эфрины и их рецепторы 54
1.2.2 Эфрины и их рецепторы в сосудистой системе 60
1.2.3 Семафорины и их рецепторы 63
1.2.4 Роль Семафоринов и их рецепторы в сосудистой системе 65
1.2.5 Нетрины и их рецепторы 69
1.2.6 Нетрины и их рецепторы в сосудистой системе 70
1.2.7 Cлит лиганды и Robo рецепторы 74
1.2.8 Слит лиганды и Robo рецепторы в сосудистой системе 75
1.2.9 Урокиназная система 78
1.3 Кадгерины в процессах морфогенеза 87
1.3.1 «Классические» кадгерины 87
1.3.2 Экспрессия кадгеринов в нервной системе в эмбриогенезе 93
1.3.3 Роль кадгеринов в развитии сердца и сосудов 95
1.3.4 Т-кадгерин 97
1.3.5 Навигационная роль Т-кадгерина в нервной системе 100
1.3.6 «Гормоноподобные» эффекты липопротеидов низкой плотности (ЛНП). Т-кадгерин и ЛНП 104
ГЛАВА 2. Материалы и методы 110
2.1 Антитела и реагенты 110
2.2 Культивирование эукариотических клеток 112
2.3 Трансфекция эукариотических клеток 112
2.4 Создание лентивирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC 115
2.5 Создание аденовирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC 116
2.6 Вестерн блоттинг (метод иммуноблоттинга) 117
2.6.1 Приготовление лизатов клеток 117
2.6.2 Определение концентрации белка в лизатах клеток 117
2.6.3 Вестерн блоттинг 117
2.7 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток и конфокальная микроскопия 118
2.8 Измерение SRE активности в NIH3T3 клетках 119
2.9 Выделение активных Rho ГТФаз (GST pull-down assay) 120
2.10 Измерение проницаемости эндотелиального монослоя in vitro 120
2.11 Трипсинизация эндотелиальных клеток 121
2.12 Разделение лизатов клеток на субклеточные фракции 121
2.13 Оценка пролиферация эндотелиальных клеток 122
2.14 Метод измерения адгезии эндотелиальных клеток 122
2.15 Метод измерения апоптоза в эндотелиальных клетках 123
2.16 Измерение миграции эндотелиальных клеток в камере Бойдена 123
2.17 Метод изучения формирования капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками 124
2.18 Экспериментальные животные 124
2.19 Анализ экспрессии Т-кадгерина в раннем эмбриональном развитии у мыши 125
2.19.1 Получение датированной беременности мыши 125
2.19.2 Получение эмбрионов мыши на постимплантационной стадии развития 125
2.19.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание мышиных эмбрионов антителами против Т-кадгерина 125
2.19.4 Трансформация E.coli, амплификация и очистка плазмид для in situ гибридизации 126
2.19.5 Линеаризация плазмид для in situ гибридизации 126
2.19.6 Синтез РНК-содержащей пробы для in situ гибридизации 127
2.19.7. Гибридизация мышиных эмбрионов in situ 128
2.20 Эксплантная модель ex vivo аорты крысы 129
2.21 Подкожная имплантация Матригеля мышам 129
2.21.1 Оценка содержания гемоглобина 130
2.21.2 Выявление сосудов в Матригеле с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания 130
2.21.3 Подсчт сосудов и статистический анализ 131
2.22 Приготовление криосрезов тканей человека и животных 131
2.23 Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов биопсийного материала кожи человека 131
2.24 Модель гематогенно метастазирующей в лгкие меланомы у мышей in vivo 132
2.25 Анализ кинетики роста и метастазирования клеток меланомы B16F10 133
2.26 Иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов первичных узлов меланомы 134
2.27 Модель хориоаллантоиcной мембраны куриного эмбриона in vivo 135
2.28 Оценка пролиферации клеток B16F10 in vitro 136
2.28.1 Метод подсчта абсолютного числа клеток 136
2.28.2 Метод измерения клеточного индекса 136
2.28.3 Оценка распределения клеток B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro 137
2.29 Оценка уровня некроза и апоптоза клеток B16F10 in vitro 138
2.30 Анализ экспрессии генов в клетках клонов B16F10 in vitro 138
2.30.1 Выделение РНК 138
2.30.2 Синтез кДНК и полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (RT-PCR) 138
2.30.3 Синтез кДНК и анализ профиля экспрессии генов с помощью наборов RT2 Profiler PCR Array 141
2.31 Концентрирование кондиционированной среды клеток B16F10 141
2.32 Оценка инвазивного потенциала клеток B16F10 in vitro 141
2.33 Получение мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК-ЖТ) мыши 143
2.34 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию и миграцию МСК-ЖТ in vitro 143
2.34.1 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию МСК-ЖТ 143
2.34.2 Влияние среды от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ 144
2.35 Статистическая обработка результатов 145
2.36 Иммуногистохимическое окрашивание криосрезов аорты человека 145 2.37 Выделение и йодирование липопротеидов низкой плотности 146
2.38 Определение поверхностного связывания 125I-ЛНП с клетками 147
2.39 Определение концентрации внутриклеточного Ca2+ 147
2.40 Оценка влияния липопротеидов низкой плотности на миграцию L929 клеток 150
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 151
3.1 Выявление экспрессии Т-кадгерина в эмбриогенезе у мыши 152
3.1.1 Синтез РНК пробы 152
3.1.2 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном головном мозге у мыши 156
3.1.3 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном сердце 161
3.2 Т-кадгерин и опухолевая прогрессия 163
3.2.1 Т-кадгерин и опухолевый рост 164
3.2.2 Строма играет важную роль в регуляции роста и прогрессии опухолей 165
3.2.3 Т-кадгерин и васкуляризация опухолей 166
3.2.4 Потеря экспрессии Т-кадгерина в кератиноцитах и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с процессами озлокачествления немеланомных новообразований кожи человека 168
3.2.4.1 Нормальная кожа 169
3.2.4.2 Псориаз 171
3.2.4.3 Актинический (солнечный) кератоз (АК) 173
3.2.4.4 Кератоакантома (КА) 175
3.2.4.5 Базальноклеточный рак (базалиома) 178
3.2.4.6 Плоскоклеточный рак или плоскоклеточная карцинома (ПР) 183
3.2.4.7 Метатипический рак (МР) 186
3.2.4.8 Потеря экспрессии Т-кадгерина в опухолевых клетках и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с опухолевой прогрессией меланомы 190
3.2.4.9 Экспрессия Т-кадгерина в меланоме человека 192
3.3 Т-кадгерин и меланома 198
3.3.1 Анализ экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы В16F10 198
3.3.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на пролиферацию клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro 202
3.3.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro 204
3.3.4 Влияние экспрессии Т-кадгерина на апоптоз и некроз клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro 204
3.3.5 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию первичного узла меланомы B16F10 на модели гематогенно метастазирующей в лгкие меланомы у мышей 206
3.3.5.1 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост первичного узла мышиной меланомы B16F10 in vivo 206
3.3.5.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на частоту очагов некроза на срезах первичных узлов меланомы В16F10 208
3.3.5.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на васкуляризацию первичных узлов мышиной меланомы 208
3.3.5.4 Экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы вызывает активацию стромы и увеличивает вклад стромального компонента в формирование первичных узлов мышиной меланомы B16F10 210
3.3.5.5 Изучение влияния экспрессии Т-кадгерина на метастазирование клеток меланомы in vivo 211
3.3.6 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на пролиферацию и миграцию
МСК-ЖТ in vitro 213
3.3.6.1 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ 213 3.3.6.2 Исследование влияния среды роста от клеток клонов B16F10 на
пролиферацию МСК-ЖТ 215
3.3.7 Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на инвазивный потенциал клеток клонов B16F10 in vitro 216
3.3.8 Исследование влияния Т-кадгерина на экспрессию цитокинов, факторов роста и матриксных металлопротеиназ в клетках B16F10 in vitro 218
3.3.9 Влияние экспрессии Т-кадгерина на неоангиогенез в меланоме В16F10 на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона 228
3.3.10 Обсуждение результатов 230
3.4 Выявление роли Т-кадгерина в процессах ангиогенеза 238
3.4.1 Введение клеток, экспрессирующих Т-кадгерин, локально подавляет ангиогенез в бляшках Матригеля 238
3.4.2 Экспрессия Т-кадгерина подавляет образование капилляров, но не влияет на формирование зрелых сосудов 240
3.4.3 Рекомбинантный аминотерминальный ЕС1 домен Т-кадгерина подавляет ангиогенез in vitro 244
3.4.4 Т-кадгерин подавляет миграцию эндотелиальных клеток, но не влияет на их адгезию, пролиферацию и апоптоз 247
3.4.5 Обсуждение результатов 252
3.5 Т-кадгерин и проницаемость сосудов. Сигнальные эффекты Т-кадгерина 256
3.5.1 Распределение экспрессии Т-кадгерина во фракциях эндотелиальных клеток после лентивирусной трансдукции 257
3.5.2 Экспрессия Т-кадгерина регулирует проницаемость монослоя эндотелия 261
3.5.3 Гиперэкспрессия Т-кадгерина вызывает образование межклеточных щелей и исчезновение VE-кадгерина из межклеточных контактов в эндотелиальных клетках 263
3.5.4 Гиперэкспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках вызывает клатрин-зависимую интернализацию VE-кадгерина и деградацию в лизосомах 268
3.5.5 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает уровень фосфорилирования VE-кадгерина по тирозину Y731 в эндотелиальных клетках 275
3.5.6 Т-кадгерин активирует SRE в фибробластах NIH3T3 279
3.5.7 Т-кадгерин активирует Rac1 и Cdc42, но не влияет на активность RhoA в фибробластах NIH3T3 282
3.5.8 Т-кадгерин активирует малые Rho ГТФазы RhoA, Rac1 и, Cdc42 и усиливает сборку стресс-фибрилл актина в эндотелиальных клетках 284
3.5.9 Т-кадгерин фосфорилирует LIMK1 и влияет на полимеризацию микротрубочек в эндотелиальных клетках 285
3.5.10 Т-кадгерин влияет на полимеризацию стресс-фибрилл актина в эндотелиальных клетках 289
3.5.11 Обсуждение результатов 295
3.6 Т-кадгерин при атеросклерозе 302
3.6.1 Экспрессия Т-кадгерина в здоровых сосудах 304
3.6.2 Экспрессия Т-кадгерина в сосудах при атеросклерозе 308
3.6.2.1 Липидная полоска 308
3.6.2.2 Нестабильная фиброатерома 311
3.6.2.3 Мягкий кальциноз 312
3.6.3 Обсуждение результатов 314
3.7 Т-кадгерин-рецептор липопротеидов низкой плотности 318
3.7.1 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин. Анализ экспрессии Т-кадгерина в клонах 318
3.7.2 Связывание [125I]-ЛНП с мембранами клеток L929 и HEK293 319 3.7.3 Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция 323
3.7.4 ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин 334
3.7.5 Обсуждение результатов 336
ГЛАВА 4. Заключение 339
Выводы 347
Список литературы
