Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 16
1.1 Аптамеры 16
1.2 Мишени аптамеров 17
1.3 Аффинность и специфичность аптамеров 19
1.4 Конформации аптамеров 21
1.5 Библиотеки, использующиеся для селекции аптамеров 25
1.6 Технологии получения аптамеров 26
1.7 Модификация аптамеров 31
1.8 Анализ аптамеров 33
1.9 Использование аптамеров в качестве диагностических средств 34
1.9.1 Электрохимический аптасенсор 36
1.9.2 Оптический аптасенсор, основанный на флуоресценции 38
1.10 Аптамеры для идентификации микроорганизмов 40
1.11 Аптамеры для диагностики онкологических заболеваний 41
1.12 Идентификация новых биомаркеров c помощью аптамеров 47
1.13 Использование аптамеров в качестве средств терапии 48
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 53
2.1 Объекты исследований 54
2.1.1 Опухолевые клетки легкого человека 54
2.1.2 Бактерии S.enteritidis и S.typhimurium 55
2.1.3 Асцитная карцинома Эрлиха 55
2.1.4 Клетки и клеточные линии 55
2.1.5 Онколитические вирусы Vesicular stomatitis и Vaccinia JX594 57
2.2 ДНК-библиотеки, праймеры, аптамеры 58
2.3 ПЦР-амплифкация 59
2.4 Контроль селекции аптамеров с помощью электрофореза 60
2.5 Выделение и подготовка клеток-мишеней 60
2.5.1 Выделение клеток опухоли и здорового легкого 60
2.5.2 Выделение лимфоцитов 61
2.5.3 Приготовление гистологических срезов 61
2.6 Селекция ДНК-аптамеров 62
2.6.1. Базовый cell-SELEX in vitro 62
2.6.2 Селекция аптамеров к тканям рака легкого человека 63
2.6.3 Селекция аптамеров к плазматической мембране и органеллам асцитных клеткок карциномы Эрлиха 64
2.6.4 Селекция аптамеров к клеточным стенкам сальмонелл с различной лекарственной устойчивостью 66
2.6.5 Селекция ДНК-аптамеров к онколитическим вирусам 69
2.6.6 Селекция переключаемых аптамеров к вирусу VSV 71
2.6.7 Селекция ДНК-аптамеров к антителам, нейтрализующим вирус vesicular stomatitis 73
2.6.8 Селекция аптамеров, проникающих через гематоэнцефалический барьер (селекция in vivo) 74
2.7 Оценка аффинности и специфичности связывания аптамеров 76
2.7.1. Метод проточной цитометрии 76
2.7.2 Определение констант диссоциации аптамеров 77
2.7.3 Флуоресцентная и конфокальная микроскопия 79
2.8 Клонирование аптамеров 79
2.9 Секвенирование и синтез аптамеров 82
2.10 Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров 82
2.11 Оценка биологического эффекта аптамеров к асцитным клеткам карциномы Эрлиха 83
2.12 Определение способности аптамеров нейтрализовать антитела 84
2.13 Определение влияния димерных и тетрамерных аптамерных конструкций на инфицирование VSV клеточных линий в присутствии нейтрализующих антител 86
2.14 Исследование антибактериального эффекта аптамеров к S.entaritidis и S.typhimurium 88
2.15 Идентификация мишеней аптамеров 91
2.15.1 Выделение белка-мишени методом аффинного обогащения 91
2.15.2 Масс-спектрометрическая идентификация белков 95
2.15.3 Статистический анализ результатов масс-спектрометрии 97
2.16 Получение биосенсоров из ДНК-аптамеров на стеклянной и золотой подложках 98
2.16.1 Биосенсор на стеклянной подложке с использованием стрептавидина 98
2.16.2 Биосенсор на золотой подложке с использованием праймеров с тиоловыми группами 99
2.17 Контроль связывания биотинилированных аптамеров со стрептавидин-модифицированной стеклянной подложкой 100
2.18 Использование микрофлуидного биочипа для определения содержания опухолевых клеток с помощью диэлектрофореза 102
2.19 Электрохимическая детекция опухолевых клеток с помощью системы xCELLigence 104
2.20 Определение количества бактерий и вирусов методом электрохимической детекции с использованием биосенсора из ДНК-аптамеров, иммобилизованных на золотой подложке 105
2.21 Введение ДНК-олигонуклеотидов внутрь клеток 107
2.22 Статистические методы исследования 108
ГЛАВА 3 Резуль таты исследований и их обсуждение 109
3.1 Селекция ДНК-аптамеров, определение аффинности и специфичности связывания
естественных пулов аптамеров 109
3.1.1 Селекция ДНК-аптамеров к тканям рака легкого 109
3.1.2 Селекция in vitro ДНК-аптамеров к асцитным клеткам карциномы Эрлиха 113
3.1.3 Селекция ДНК-аптамеров к внутриклеточным компартментам асцитных клеток карциномы Эрлиха 117
3.1.4 Селекция ДНК-аптамеров к возбудителям сальмонеллеза S.enteritidis и S.typhimurium 121
3.1.5 Селекция ДНК-аптамеров к онколитическим вирусам 128
3.1.6 Селекция аптамеров с переключаемой аффинностью 136
3.1.7 Селекция аптамеров к нейтрализующим антителам анти-Abs 140
3.1.8 Селекция ДНК-аптамеров к цитокератинам методом аффинного вытеснения и определение их аффинности и специфичности связывания 142
3.1.9 Селекция in vivo ДНК-аптамеров, способных проходить через гематоэнцефалический барьер, и определение их аффинности и специфичности связывания 143
3.1.10 Заключение 152
3.2 Использование ДНК-аптамеров для идентификации биологических мишеней 156
3.2.1 Использование ДНК-аптамеров для идентификации опухолевых клеток рака легкого человека и продуктов их распада в крови онкобольных 156
3.2.2 Выявление бактерий S.enteritidis и S.typhimurium с помощью ДНК-аптамеров 172
3.2.3 Аффинное выделение и очистка биологических мишеней с помощью аптамеров, меняющих
способность к связыванию в зависимости от наличия ионов 183
3.3 Биосенсоры на основе иммобилизованных ДНК-аптамеров для детекции бактерий,
вирусов и опухолевых клеток 186
3.3.1 Оценка жизнеспособности микроорганизмов и вирусов с помощью аптасенсоров 187
3.3.2 Сравнение эффективности методов определения содержания опухолевых клеток с помощью микрофлуидного устройства и их электрохимической детекции с использованием биосенсора на основе ДНК-аптамеров 203
3.3.3 Использование биосенсора на основе ДНК-аптамеров для электрохимической детекции циркулирующих опухолевых клеток 221
3.3.4 Определение содержания циркулирующих опухолевых клеток в образцах крови методом электрохимической детекции с использованием системы xCelligence 225
3.4 Биологические эффекты ДНК-аптамеров 230
3.4.1 Бактериостатический эффект ДНК-аптамеров к возбудителям сальмонеллеза S.enteritidis и S.typhimurium 230
3.4.2 Маскирование онколитических вирусов от нейтрализующих антител с помощью аптамеров 238
3.4.3 Противоопухолевый эффект ДНК-аптамеров к асцитным клеткам карциномы Эрлиха и опухолевым клеткам рака легкого человека 246
3.5. Внутриклеточная доставка нуклеотидов с помощью арабиногалактана 254
3.6 Использование ДНК-аптамеров к возбудителям сальмонеллеза S.enteritidis и S.typhimurium для определения их антибиотикоустойчивости 266
3.7 Выявление биомаркеров с помощью аптамеров методом аффинного обогащения 270
Заклю чение 282
Выводы 294
Список использованной литера туры 296
