Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Пероксидаза из растительного сырья: структура, свойства и применение 12
1.1.1 Строение и механизм действия пероксидаз 12
1.1.2 Влияние кальция в структуре на активность пероксидаз 14
1.1.3 Свойстваи области применения пероксидаз 14
1.1.4 Источники и технологии получения растительных пероксидаз 17
1.2 Получение ферментов 20
1.2.1 Селективные сорбенты для выделения белков 20
1.2.2 Методы выделения и очистки белков 25
1.2.3 Хроматографические методы 26
1.3 Современные подходы к созданию модифицированных форм ферментов .29
1.3.1 Носители для иммобилизации 30
Глава 2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Материалы исследования 39
2.1.1 Растительная пероксидаза 39
2.1.2 Физико-химические характеристики применяемых сорбентов 39
2.1.3 Носители для иммобилизации 42
2.1.4 Свойства хлоргексидина биглюконата 44
2.1.5 Структура и свойства гентамицина и азитромицина 44
2.1.6 Структура и свойства нипагина 45
2.1.7 Структура и свойства нипазола 46
2.1.8 Свойства альгината натрия 46
2.1.9 Свойства карбопола 47
2.1.10 Устройство и технические характеристики установки Vivaflow фирмы Sartorius Stedim Biotech для ультрафильтрации в тангенциальном режиме 47
2.2 Методы исследования 49
2.2.1 Определение концентрации белка по методу Лоури з
2.2.2 Метод определения ферментативной активности пероксидазы по пирогаллолу 51
2.2.3 Определение концентрации гентамицина 53
2.2.4 Подготовка сорбентов к работе 54
2.2.5 Гельхроматографический метод определения молекулярной массы белков 55
2.2.6 Методика постановки опытов по изучению кинетики диффузии через пористые мембраны 57
2.2.7 Методы работы с ультрафильтрационной мембранной установкой Vivaflow200 59
2.2.8 Методика определения активности пероксидазы в геле 61
2.2.9 Определение цветности раствора 61
2.2.10 Подготовка растительного сырья 64
2.2.11 Методика проведения процесса экстрагирования 64
2.2.12 Деминерализация экстрактов 65
2.2.13 Депигментация экстрактов 65
2.2.14 Определение рН оптимум сорбции в статических условиях 66
2.2.15 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной 66
2.2.16 Изучение влияния носителей и эксципиентов на активность пероксидазы 67
2.2.17 Изучение влияния носителей на активность пероксидазы в комплексе с антибиотиком 68
2.2.18 Микробиологические методы исследования 68
2.2.19 Математические методы обработки результатов 69
Глава 3 Условия сорбционно-хроматографического выделения и очистки пероксидазы из экстрактов с последующим концентрированием полученных элюатов на мембранных модулях 71
3.1 Исследование экстрактов из корней хрена и корнеплодов редьки черной, содержащих пероксидазу 71
3.1.1 Подбор условий экстрагирования пероксидазы из растительного сырья 71
3.1.2 Кинетика стабильности пероксидазы в экстрактах 73
3.1.3 Исследование зависимости активности пероксидазы от рН и температуры 74
3.1.4 Гельхроматографический анализ исходного экстракта 76
3.2 Изучение процесса депигментации экстракта на различных анионитах в динамических условиях 78
3.2.1 Гельхроматографический анализ депигментированного экстракта 82
3.3 Исследование рН оптимум сорбции в статических условиях 84
3.4 Исследование процесса сорбции пероксидазы на различных сорбентах в статических условиях 87
3.5 Подбор условий выделения и очистки пероксидазы из экстрактов в динамических условиях 93
3.6 Гельхроматографический анализ элюата, полученного после процесса десорбции 100
3.7 Подбор мембран для концентрирования элюата, содержащего пероксидазу 102
3.8 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной... 104
3.9 Сравнительная характеристика физико-химических свойств пероксидаз из различного растительного сырья 108
Глава 4 Разработка фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой 111
4.1 Исследование активности пероксидазы из корнеплодов редьки черной при модификации различными носителями 111
4.1.1 Влияние антибиотиков гентамицина, азитромицина и антисептика хлоргексидина биглюконата на активность пероксидазы 111
4.1.2 Изучение влияния а, Р и у циклодекстринов на активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной 113
4.1.3 Изучение влияния р - циклодекстринов на активность пероксидазы в комплексе с антибиотиком 116
4.1.4 Изучение процесса связывания фермента с антибиотиком и циклодекстринами 117
4.2 Разработка состава фармацевтической композиции в виде геля 118
Заключение 127
Список сокращений и условных обозначений 129
Список литературы
