Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Активность теломеразы в различных опухолях 10
1.2 Амплификация генов hTR и hTERT 13
1.3 Регуляция транскрипции TERT 13
1.3.1 Структура промотора обратной транскриптазы теломеразы 14
1.3.2 Метилирование промотора hTERT 15
1.3.3 Метилирование гистонов промотора hTERT 17
1.3.4 Ацетилирование и деацетилирование 17
1.3.5 Каскад МАРК 18
1.3.6 Онкоген Мус и его антипод Mad 18
1.3.7 Транскрипционные факторы Spl и Sp3 19
1.3.8 Ядерный фактор NF-kappaB 21
1.3.9 Транскрипционные факторы API и АР2 22
1.3.10 Онкосупрессор р53 22
1.3.11 Белки pRB, E2F и р16 23
1.3.12 Вс12 25
1.3.13 Онкосупрессор WT1 26
1.3.14 Миелоидный клеточно-специфичный белок MZF-2 26
1.3.15 Транскрипционные факторы ETS 27
1.3.16 Стероидные гормоны 28
1.3.17 Вирусная регуляция экспрессии hTERT 30
1.3.18 Влияние гипоксии на экспрессию hTERT 35
1.4 Посттранскрипционная регуляция hTERT 36
1.4.1 Регуляция сплайсинга гена hTERT 36
1.4.2 Клеточная локализация 38
1.4.3 Фосфорилирование и дефосфорилирование hTERT 39
1.5 Регуляция экспрессии теломеразной РНК 40
1.5.1 Регуляция транскрипции теломеразной РНК 42
1.5.2 Посттранскрипционная регуляция теломеразной РНК 45
1.6 Контроль доступа теломеразы на теломеры 45
1.7 Регуляция в ходе ответа на ионизирующие излучения 48
1.8 Заключение 49
2. Результаты и их обсуждение 50
2.1 Активность теломеразы в раках шейки матки 50
2.1.1 Проверка работы TRAP-теста на клеточных линиях 51
2.1.2 Активность теломеразы в опухолевых образцах 54
2.1.3 Теломеразная активность в образцах условно-нормальных тканей 58
2.2 Активация теломеразы в предраковых поражениях шейки матки 59
2.2.1 Теломеразная активность и экспрессия мРНК hTERT в образцах предраковых поражений 61
2.3 Влияние белка RPA на активность теломеразы 69
2.3.1 Приготовление клеточных экстрактов с пониженным содержанием RPA 70
2.3.2 Теломеразная активность в экстрактах с пониженным содержанием RPA 71
2.3.3 Влияние белка SSB на активность теломеразы 75
2.4 Проверка и адаптация TRAP-теста для скрининга ингибиторов теломеразы 77
3. Материалы и методы 79
3.1 Реактивы 79
3.3 Клинические материалы 79
3.4 Культивирование клеточных линий 80
3.5 Приготовление S30 экстрактов 80
3.6 Приготовление экстрактов из образцов операционных материалов 80
3.7 Приготовление S100 клеточных экстрактов 81
3.8 Обработка экстрактов РНКазой А 81
3.9 Получение и характеристика препарата RPA 82
3.10 Иммунопреципитация RPA 82
3.11 Вестерн-блот-анализ 82
3.12Т11АР-тест 83
3.13 Получение праймера TS, меченного 32Р 84
3.14 Вьщеление РНК из клинических материалов 84
3.15 Агарозный гель-электрофорез РНК 84
3.16 Получение кДНК/Обратная транскрипция 85
3.17 ПЦР 85
Выводы 87
