Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Семейство Т-четные бактериофаги 8
1.1.1. Классификация бактериофагов Т4-типа 8
1.1.2. Классические Т-четные бактериофаги 9
1.1.3. Явление частичного исключения маркеров у Т-четных фагов 10
1.2. Бактериофаг Т4 11
1.2.1. Особенности структуры и развития бактериофага Т4 11
1.2.2. Рекомбинация у бактериофага Т4. SPC-модель рекомбинации 15
1.3. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов 18
1.3.1. Общая характеристика хоминг-эндонуклеаз 18
1.3.2. Характеристика отдельных семейств хоминг-эндонуклеаз 21
1.3.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 26
1.3.4. Молекулярные механизмы хоминга... 31
1.3.5. Использование хоминг-эндонуклеаз в научных и практических целях 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36
2.2. Материалы 36
2.1.1. Среды, основные буферы и растворы 36
2.1.2. Материалы и реактивы 38
2.1.3. Штаммы бактерий и бактериофаги 39
2.1.4. Олигонуклеотиды 41
2.1.5. Плазмидные вектора 41
2.3. Методы исследования 42
2.2.1. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация 42
2.2.2. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации 43
2.2.3. Получение Т-четных бактериофагов ." 44
2.2.4. Получение фага ХСЕ6 45
2.2.5. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным центрифугированием в градиенте CsCl 46
2.1.1. Получение геномной ДНК бактериофагов и бактерий 46
2.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 47
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК 47
2.2.8. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК 48
2.2.9. Анализ рекомбинантных клонов 49
2.2.10. Электрофорез ДНК 50
2.2.11. ДНК-ДНК гибридизация (по Саузерну) 50
2.2.12. Электрофорез белков и определение концентрации белка 51
2.2.13. Экспрессия гена segC и получение препарата белка SegC 51
2.2.14. Получение экстрактов клеток Е. coli, инфицированных фагом Т4 52
2.2.15. Определение эндонуклеазной активности SegC 52
2.2.16. Определение точек расщепления SegC 53
2.2.17. Получение рекомбинатных бактериофагов 53
2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства 54
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
ГЕН SEGC ФАГА Т4 кодирует хоминг-эндонуклеазу 57
3.1. Анализ области генов 5 - 6 у Т-четных бактериофагов 57
3.2. Ген segC кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу 57
3.3. Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС 61
3.4. SegC активен на модифицированной ДНК Т-четных фагов 61
3.5. Эндонуклеаза SegC инициирует хоминг собственного гена при скрещивании Т4 и T2L 64
Разработка модели и анализ segc-инициируемой рекомбинации вг#-локусет4 67
3.6. Создание модели рекомбинации, основанной на внесении SegC сайт-специфического двунитевого разрыва в гЯ-локус 67
3.7. Зависимость ДНР-инициируемой рекомбинации от расстояния 69
3.8. Сравнение рекомбинации справа и слева от ДНР 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 74
ГЕН SEGC ФАГА Т4 кодирует хоминг-эндонуклеазу 74
SegC-инициируемая рекомбинация в r/7-локусе Т4 77
Выводы 80
Список литературы 81
