Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Цитохром P450 BM3 12
1.2 Энзимология единичных молекул ферментов 18
1.2.1 Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов 19
1.2.2 Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных молекул ферментов 25
1.3 АСМ-визуализация с использованием стандартных и сверхтонких зондов 30
1.3.1 АСМ для исследования активности отдельных молекул ферментов 34
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1 Использованные реактивы и материалы 37
2.2 Характеристика исследуемого белка 37
2.3 Методика приготовления образцов для АСМ-измерений 38
2.4 Методика АСМ-визуализации BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов 38
2.4.1 Обработка АСМ-изображений 40
2.5 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента 41
2.6 Дополнительные методы 46
2.6.1 Масс-спектрометрический анализ 46
2.6.2 Фотонная корреляционная спектроскопия 48
2.7 Методика АСМ-мониторинга температурной
денатурации BM3 49
2.8 Флуоресцентный анализ 50
Глава 3. Результаты и их обсуждение 52
3.1 АСМ-визуализация и определение олигомерного состояния BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов 52
3.1.1 Исследование олигомерного состояния BM3 методом фотонной корреляционной спектроскопии 52
3.1.2 АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов 55
3.1.3 АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов 59
3.1.4 Определение олигомерного состояния BM3 из данных АСМ-экспериментов 62
3.2 Мониторинг активности единичных молекул BM3 c использованием АСМ 66
3.2.1 АСМ-измерения колебаний высоты BM3 на разных стадиях каталитического цикла фермента 66
3.2.2 Температурная зависимость средней амплитуды колебаний высоты молекул BM3 72
3.2.3 Обсуждение результатов АСМ-мониторинга активности единичных молекул BM3 73
3.3 Исследование температурной денатурации BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа 76
3.3.1 Флуоресцентный анализ температурной денатурации BM3 76
3.3.2 АСМ-исследование зависимости олигомерного состояния BM3 от температуры 80
3.3.3 Обсуждение полученных результатов исследования температурной денатурации BM3 92 Заключение 96
Выводы 98
Благодарности 99
Литература
