Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Структура и функции минисателлитных последовательностей ДНК 10
1.1.1. Общая характеристика минисателлитов 10
1.1.2. Тандемные повторы как факторы модуляции экспрессии генов 12
1.1.3. Минисателлиты как факторы модуляции экспрессии генов 13
1.1.4. Минисателлитные ДНК и болезни человека 15
1.1.5. Методы изучения роли минисателлитных последовательностей ДНК в регуляции экспрессии генов 18
1.2. Характеристика гена ACAP3 (CENTB5) 20
1.3. Характеристика минисателлита UPS29 24
1.4. Метилирование минисателлитных ДНК 26
1.4.1. Метилирование ДНК как эпигенетическая модификация нуклеиновых кислот 26
1.4.2. Метилирование ДНК и нестабильность повторяющихся последовательностей 28
1.4.3. Метилирование тандемных повторов ДНК при различных болезнях человека 29
1.5. Генетические и эпигенетические факторы эпилепсии 31
1.5.1. Гены, вовлеченные в патогенез эпилепсии 31
1.5.2. Роль минисателлитных последовательностей в патогенезе эпилепсии 35
1.5.3. Изучение экспрессии генов в клетках крови при эпилепсии 35
1.5.4. Эпигенетические факторы эпилепсии 40
1.6. Генетические и эпигенетические факторы болезни Паркинсона 42
1.6.1. Гены и локусы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона 42
1.6.2. Роль минисателлитных последовательностей в патогенезе болезни Паркинсона 45
1.6.3. Изучение экспрессии генов в клетках крови при болезни Паркинсона 46
1.6.4. Эпигенетические факторы болезни Паркинсона 52
Заключение по обзору литературы 54
ГЛАВА II. Материалы и методы 55
2.1. Материал исследования 55
2.1.1. Пациенты и группы контроля 55
2.1.2. Клеточные линии: эмбриональная тератокарцинома мыши F9, HeLa человека, первичные астроциты крысы 56
2.1.3. Плазмидные конструкции pR26-EGFP, pR26-EGFP-UPS29 56
2.2. Методы исследования 58
2.2.1. Выделение геномной ДНК 58
2.2.2. Определение аллельных вариантов минисателлита UPS29 с помощью ПЦР 58
2.2.3. Ферментативный гидролиз геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами 59
2.2.4. Электрофорез в агарозном геле и полиакриламидном геле 60
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 60
2.2.6. Культивирование эукариотических клеток линий HeLa, F9, астроцитов крысы 61
2.2.7. Временная трансфекция клеток линий HeLa, F9 и астроцитов крысы 61
2.2.8. Стабильная трансфекция клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 61
2.2.9. Оценка флуоресценции белка EGFP в культуре трансфицированных клеток 62
2.2.10. Выявление встроенных плазмидных конструкций методом ПЦР 62
2.2.11. Выделение тотальной РНК 63
2.2.12. ДНКазная обработка 63
2.2.13. Обратная транскрипция 64
2.2.14. Определение нормализованного уровня экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови у здоровых людей, пациентов с эпилепсией и пациентов с болезнью Паркинсона 64
2.2.15. Определение числа копий гена ACAP3 у здоровых людей, пациентов с эпилепсией и пациентов с болезнью Паркинсона 65
2.2.16. Статистическая обработка данных 66
ГЛАВА III. Результаты исследования 67
3.1. Анализ ассоциаций минисателлита UPS29 с эпилепсией и болезнью Паркинсона 67
3.2. Анализ метилирования минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии и болезни Паркинсона 69
3.3. Оценка уровня экспрессии генов ACAP3, CSTB в лейкоцитах периферической крови при эпилепсии и болезни Паркинсона 72
3.4. Изучение влияния различных аллелей UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной и стабильной трансфекции клеточных культур плазмидными конструкциями pR26-EGFP-UPS400, pR26-EGFP-UPS900, pR26-EGFP-UPS1500 75 3.4.1. Оценка флуоресценции белка EGFP при временной трансфекции клеток HeLa,
F9 и астроцитов крысы 76
3.4.2. Оценка интенсивности флуоресценции белка EGFP при стабильной трансфекции в клетках F9 78
ГЛАВА IV Обсуждение результатов 79
4.1. Короткие аллели минисателлита UPS29 у женщин как фактор риска развития симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона 79
4.2. Изменение статуса метилирования ДНК минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии у женщин 83
4.3. Изменение уровня экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови при эпилепсии и болезни Паркинсона 85
4.3.1. Изменение уровня экспрессии гена ACAP3 при эпилепсии и болезни Паркинсона 85
4.3.2. Изменение уровня экспрессии гена CSTB при эпилепсии и болезни Паркинсона 88
4.4. Энхансерный эффект минисателлита UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной трансфекции клеток нейронального и глиального происхождения 93
4.5. Супрессорное влияние минисателлитного повтора UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по стабильной трансфекции клеток линии F9 95
Заключение 97
Выводы 99
Список сокращений 100
Список литературы 101
Благодарности 124
