Введение
1. Введение 11
1.1. Общая характеристика и классификация Молликут 11
1.2. Репарация ДНК и поддержание геномной стабильности у бактерий
1.2.1. Система SOS ответа 13
1.2.2. Гомологическая рекомбинация 19
1.2.3. Система эксцизионной репарации нуклеотидов 20
1.2.4. Система эксцизионной репарации азотистых оснований 22
1.2.5. Система репарации мисматчей 25
1.2.6. Устойчивость ДНК к повреждениям и синтез с низкой точностью 27
1.3. Гистоноподобный белок HU 31
2. Материалы и методы 34
2.1. Олигонуклеотиды 34
2.2. Культивирование Mycoplasma gallisepticum и получение клеточного экстракта 35
2.3. Метод торможения ДНК в геле 36
2.4. Идентификация белков, связывающих мисматчи, из клеточного экстракта M. gallisepticum 37
2.5. Гидролиз белков в полиакриламидном геле 38
2.6. Идентификация белков методом МАЛДИ-МС 38
2.7. Расчет констант диссоциации 39
2.8. Получение чистого препарата целевого белка Hup 2 из M. gallisepticum в клетках E. coli 41
2.9. Выделение ДНК 42
2.10. Комплементационный тест генов hup 1 и hup 2 из M. gallisepticum в
E. coli з
2.11. Выделение РНК и синтез кДНК 44
2.12. Количественная ПЦР в реальном времени 44
2.13. Капельно-цифровая ПЦР 45
2.14. Определение числа копий РНК и ДНК 45
2.15. Определение предельно переносимых воздействий 46
2.16. Определение кинетики роста культуры 46
2.17. Праймеры и молекулярные зонды для количественной ПЦР 47
2.18. Получение клеточного экстракта и разделение белков в одномерном полиакрамидном геле 47
2.19. Хромато-масс-спекрометрия 48
2.20. Анализ масс-спектрометрических данных 49
2.21. Двумерный гель-электрофорез с дифференциальной окраской цианинами 50
2.22. Сравнительный анализ и реконструкция системы репарации 51
2.23. Статистический анализ изменений уровней мРНК 52
2.24. Кластеризация генов по паттернам изменения экспрессии при тепловом шоке 53
2.25. Измерение АТФ 53
2.26. Флуорометрическое определение скорости образования перекиси водорода 53
3. Результаты и обсуждение 54
3.1. M. gallisepticum обладает белками, способными распознавать ошибочно спаренные основания в ДНК 54
3.2. Очистка и идентификация мисматч-связывающих белков M. gallisepticum 3.4. Связывание белка mgHU с поврежденной ДНК сильно при физиологическом значении ионной силы 61
3.5. Связывание различных ДНК-структур, типичных для репарационного пути MMR 63
3.6. Комплементационный тест 3.8. Реконструкция системы репарации ДНК у M. gallisepticum 73
3.9. Представленность транскриптов генов систем репарации в клетке 76 3.10. Представленность участников систем репарации в клетке на
белковом уровне 78
3.12. Протеомное профилирование в условиях теплового шока 86
3.13. Тепловой стресс «разгоняет» клеточный метаболизм приводя к повышенному уровню внутреклеточной АТФ, окислительному стрессу, сопровождающемуся повреждениями ДНК 89
Заключение 93
Список литературы 96
