Оглавление
Список сокращений ................................................................................................................. 4
1. Введение ............................................................................................................................. 6
1.1 Цель исследования ....................................................................................................................... 6
1.2 Задачи исследования ................................................................................................................... 6
1.3 Актуальность исследования ...................................................................................................... 7
1.4 Научная новизна и практическая значимость исследования ............................................. 7
1.5 Публикации и апробация работы ............................................................................................. 9
2. Обзор литературы .............................................................................................................. 10
2.1 SARS-CoV-2: жизненный цикл вируса, значение протеаз ................................................. 10
2.1.1 Пандемия COVID-19 .......................................................................................................................... 10
2.1.2 Жизненный цикл SARS-CoV-2 ......................................................................................................... 12
2.1.3 Структурные белки и протеазы SARS-CoV-2 ................................................................................ 18
2.1.3.1 S-белок ................................................................................................................................................ 18
2.1.3.2 N-белок ............................................................................................................................................... 21
2.1.3.3 E-белок ............................................................................................................................................... 22
2.1.3.4 M-белок .............................................................................................................................................. 25
2.1.3.5 Моделирование структуры вириона SARS-CoV-2 и олигомеризация М-белка .................. 27
2.1.3.6 Главная протеаза Mpro ................................................................................................................... 29
2.1.3.7 Папаин-подобная протеаза PLpro ................................................................................................. 30
2.1.4 Противовирусная терапия и ингибиторы SARS-CoV-2 .............................................................. 33
2.2 Генетически кодируемые сенсоры: принцип работы и преимущества .......................... 39
2.2.1 Транслокационные биосенсоры ....................................................................................................... 42
2.2.2 FRET-сенсоры ..................................................................................................................................... 44
2.2.3 Биосенсоры на основе одного флуоресцентного белка ................................................................ 46
2.2.4 Биосенсоры на основе флуоресцентной комплементации .......................................................... 48
2.2.5 Биосенсоры на основе димеризации ............................................................................................... 50
2.3 Генетически кодируемые сенсоры на протеазы .................................................................. 52
3. Материалы и методы ......................................................................................................... 60
3.1 Молекулярно-генетические методы ....................................................................................... 60
3.1.1 Амплификация последовательностей ДНК ................................................................................... 60
3.1.2 Сборка генно-инженерных конструкций по системе MoClo ...................................................... 60
3.1.3 Гель-электрофорез .............................................................................................................................. 63
3.1.4 Рестрикция ........................................................................................................................................... 63
3.1.5 Лигирование ........................................................................................................................................ 63
3
3.1.6 Очистка ДНК из агарозного геля и реакционных смесей .......................................................... 63
3.1.7 Трансформация компетентных клеток E. Coli ............................................................................. 64
3.1.8 Выделение плазмидной ДНК из культуры клеток E. coli ........................................................... 64
3.1.9 Секвенирование ДНК ........................................................................................................................ 64
3.2 Методы работы с культурами эукариотических клеток .................................................... 65
3.2.1 Приготовление сред ............................................................................................................................ 65
3.2.2 Ведение культуры эукариотических клеток ................................................................................. 65
3.2.3 Трансфекция эукариотических клеток .......................................................................................... 65
3.2.4 Лентивирусная трансдукция эукариотических клеток .............................................................. 66
3.2.5 Иммуноцитохимическое окрашивание .......................................................................................... 66
3.2.6 Инфицирование SARS-CoV-2 ........................................................................................................... 67
3.3 Флуоресцентная микроскопия ................................................................................................ 68
3.3.1 Широкопольная флуоресцентная микроскопия .......................................................................... 68
3.3.2 Конфокальная микроскопия ............................................................................................................ 68
3.3.3 Обработка изображений и статистический анализ ...................................................................... 68
4. Результаты и обсуждение .................................................................................................. 70
4.1 Изучение олигомеризационных свойств М-белка SARS-CoV-2 ........................................ 71
4.1.1 Экспрессия М-белка SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293Т .................................................. 71
4.1.2 Экспрессия М-белка SARS-CoV-2 в клетках линии HeLa .......................................................... 75
4.2 Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры для изучения активности папаин-
подобной протеазы PLpro SARS-CoV-2 в живых клетках ....................................................... 85
4.2.1 Генетически кодируемый красный FRET-сенсор для изучения активности растворимой
PLpro .............................................................................................................................................................. 86
4.2.2 Генетически кодируемые транслокационные сенсоры для изучения активности мембран-
ассоциированной PLpro .............................................................................................................................. 90
4.2.2.1 PLpro-sensor-TA ................................................................................................................................ 92
4.2.2.2 PLpro-sensor-Plus .............................................................................................................................. 94
4.2.2.3 PLpro-ERNuc ..................................................................................................................................... 97
5. Заключение ........................................................................................................................ 104
6. Выводы ............................................................................................................................... 107
Список литературы .............................................................................................................. 108
