Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Механизмы клеточной гибели 11
1.2. Молекулярные механизмы процесса аутофагии 12
1.2.1. Консервативность генов, кодирующих процесс аутофагии 17
1.2.2. Регуляция активности процесса аутофагии в опухолевых клетках 18
1.3. Роль аутофагии в канцерогенезе и прогрессии опухоли 23
1.4. Роль аутофагии среди других механизмов клеточной гибели 27
1.5. Роль аутофагии в подавлении опухолевой инициации 29
1.6. Роль аутофагии в прогрессии заболевания на поздних стадиях 29
1.7. Потенциальные мишени для таргетной терапии злокачественных опухолей в клинической онкологии 33
1.8. Роль аутофагии при злокачественной меланоме кожи 41
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Клеточные линии 44
2.2. Определение антипролиферативной активности с помощью МТТ метода 44
2.3. Модуляция цитотоксичности и определение взаимодействия препаратов в культуре in vitro 45
2.4. Определение колониеобразования 45
2.5. Трансфекция клеточных линий 46
2.6. Оценка миграционной способности клеток методом миграции «в рану» 46
2.7. Определение апоптоза методом проточной цитометрии 46
2.8. Анализ клеточного цикла 48
2.9. Определение активирующих мутаций в гене BRAF 49
2.10. Анализ экспрессии генов 49
2.11. Проведение Вестерн-блоттинга. Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле 50
2.12. Иммуноблоттинг 51
2.13. Анализ течения аутофагии и лизосомального содержимого 52
2.14. Статистический анализ 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Влияние мутации V600 гена BRAF на уровень аутофагии в клеточных линиях меланомы человека 54
3.1.1. Влияние мутации гена BRAF на базальный уровень аутофагии 54
3.1.2. Влияние мутации гена BRAF на индукцию аутофагии 56
3.2. Изучение цитотоксичности на клетах меланомы человека 57
3.2.1. Исследовние цитотоксического действия TMZ 57
3.2.2. Влияние ингибиторов аутофагии на цитотоксичность TMZ 58
3.2.3. Влияние ЭПР-стресса на цитотоксичность ТМZ и его комбинации с ингибитором аутофагии CQ 61
3.3. Влияние комбинированного действия TMZ с ингибиторами аутофагии на клеточный цикл 65
3.4. Механизмы гибели клеток меланомы человека под действием TMZ и его комбинаций с ингибиторами аутофагии 70
3.4.1.Изучение апоптотической гибели клеток меланомы человека под действием TMZ и CQ или LY 70
3.4.2. Исследование аутофагии в клетках меланомы при комбинации TMZ и CQ или LY 71
3.4.3. Изучение апоптотической гибели клеток меланомы человека при ЭПР стрессе 74
3.4.4. Исследование аутофагии в клетках меланомы при ЭПР-стрессе 78
3.5. Изучение взаимосвязи аутофагии и ЭМП в клеточных линиях меланомы 82
3.5.1. Влияние аутофагии на маркеры ЭМП 82
3.5.2. Влияние ингибиторов аутофагии на миграционную способность клеток меланомы 83
3.5.3. Изучение экспрессии маркеров ЭМП под действием ингибиторов аутофагии 87
Глава 4. Обсуждение результатов 92
Заключение 103
Выводы 105
Список сокращений 107
Список литературы 110
