Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность темы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы 9
1.4. Основные положения, выносимые на защиту 10
1.5. Апробация работы 11
2. Обзор литературы 11
2.1. Канцерогенез и опухолевая прогрессия 11
2.1.1. Особенности опухолевой клетки 11
2.1.2. Эпителиально-мезенхимальный переход 13
2.2. Поджелудочная железа 15
2.2.1. Поджелудочная железа: строение и функции 15
2.2.2. Эмбриональное развитие поджелудочной железы 18
2.2.3. Патологии поджелудочной железы 20
2.3. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ) 22
2.3.1. Патогенез и этапы развития ПАКПЖ 22
2.3.2. Биомаркеры ПАКПЖ 24
2.4. Основные регуляторы дифференцировки клеток поджелудочной железы 26
2.4.1. PDX1 27
2.4.2. PTF1 29
2.4.3. Гепатоцитарные ядерные факторы 30
2.5. Транскрипционный фактор HNF4 37
2.5.1. Строение гена HNF4A и его изоформы 37
2.5.2. Транскрипционная активность HNF4 39
2.5.3. HNF4 в развитии и функционировании эпителиальных органов и тканей 40
2.5.4. Другие представители семейства HNF4 43
2.5.5. Механизмы регуляции экспрессии HNF4 44
2.6. Роль HNF4 в канцерогенезе 46
2.6.1. HNF4 в развитии гепатоцеллюлярной карциномы 46
2.6.2. HNF4 в опухолях других органов 48
2.7. Заключение обзора литературы 50
3. Материалы и методы 51
3.1. Растворы, среды и реактивы 51
3.2. Олигонуклеотидные праймеры 53
3.3. Ферменты 55
3.4. Плазмидные векторы 55
3.5. Клеточные линии 56
3.6. Клинические образцы ткани 56
3.7. Наращивание и выделение плазмид 57
3.8. Лентивирусная инфекция клеток линий ПАКПЖ 57
3.9. Выделение суммарной клеточной РНК 58
3.10. Обратная транскрипция 59
3.11. Полимеразная цепная реакция 59
3.12. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени 60
3.13. Белковый ДСН-электрофорез в ПААГ 61
3.14 Электроперенос белков из ПААГ на PVDF-мембрану 62
3.15. Иммуноблоттинг 62
3.16. Фиксация клеток 63
3.17. Иммунофлюоресцентная окраска клеток на HNF4TOT и E-кадхерин 63
3.18. Определение интенсивности синтеза ДНК 64
3.19. Клоногенный тест 64
3.20. Измерение кинетики роста клеточных культур in vitro 65
3.21. Миграционный тест 65
3.22. Статистическая обработка данных 66
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Выбор модельной системы для исследования роли изменения экспрессии
HNF4 в клетках ПАКПЖ 67
4.2. Выбор исследуемых тканеспецифических генов, связанных с уровнем дифференцировки и функциями поджелудочной железы 70
4.3. Характеристика экспрессии генов в культурах клеток ПАКПЖ с различным уровнем дифференцировки 72
4.4. Исследование влияния экзогенной экспрессии HNF4 на злокачественный потенциал культур низкодифференцированных клеток ПАКПЖ Panc1 и
MiaPaCa 74 4.4.1. Получение клеточных культур Panc1 и MiaPaCa2, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF41 и HNF47 74
4.4.2. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 74
4.4.3. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках Panc1-HNF4 и
4.4.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 78
4.4.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках Pancl-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 83
4.4.6. Влияние экзогенной экспрессии HNF4 на биологические характеристики
4.4.6.1. Определение скорости роста клеточных культур Panc1-HNF4 и
4.4.6.2. Исследование интенсивности синтеза ДНК в клетках Panc1-HNF4
4.4.6.3. Снижение колониеобразующей способности клеток Panc1 и
MiaPaCa2 при экзогенной экспрессии HNF4 91
4.4.6.4. Усиление способности клеток Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 к
4.5. Исследование влияния подавления синтеза HNF4 на злокачественный потенциал культуры высокодифференцированных клеток ПАКПЖ СаРап2 99
4.5.1. Получение клеточных культур CaPan2 с подавленным синтезом HNF4 99
4.5.2. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках CaPan2-shHNF4 100
4.5.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в
4.5.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в
4.5.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках
4.5.6. Влияние подавления синтеза HNF4 на биологические характеристики
4.5.6.1. Повышение скорости роста клеточных культур CaPan2-shHNF4 109
4.5.6.2. Усиление интенсивности синтеза ДНК в клетках CaPan2-shHNF4 110 4.5.6.3. Увеличение колониеобразующего потенциала клеток CaPan2 при
подавлении синтеза HNF4 111
4.5.6.4. Повышение способности клеток CaPan2-shHNF4 к направленной миграции 112
4.6. Исследование влияния подавления синтеза HNF4 на злокачественнй потенциал культуры умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ AsPC1 116
4.6.1. Получение клеточных культур AsPC1 с подавленным синтезом HNF4 116
4.6.2. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках AsPC1-shHNF4 117
4.6.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в
клетках AsPC1-shHNF4 118
4.6.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в клетках AsPC1-shHNF4 120
4.6.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках AsPC1-shHNF4 123
4.6.6. Влияние подавления синтеза HNF4 на биологические характеристики клеток AsPC1 126
4.6.6.1. Замедление роста культур AsPC1-shHNF4 in vitro 126
4.6.6.2. Ослабление ДНК-синтетической активности клеток AsPC1 при подавлении синтеза HNF4 127
4.6.6.3. Снижение колониеобразующего потенциала клеток AsPC1 shHNF4 128
4.6.6.4. Усиление способности клеток AsPC1 к направленной миграции при подавлении синтеза HNF4 129
4.7. Исследование уровней экспрессии HNF4 и других тканеспецифических генов в клинических образцах ткани ПАКПЖ человека 132
4.7.1. Анализ уровней экспрессии HNF4 и групп его изоформ в панели клинических образцов ПАКПЖ 132
4.7.2. Исследование корреляции между экспрессией изоформ HNF4 и панкреа специфических генов в клинических образцах ПАКПЖ 136
5. Заключение 140
6. Выводы 143
7. Список сокращений 144
8. Список литературы
