Введение
1. Ангиотензин-превращающий фермент 8
1.1. Физиологическая значимость ангиотензин-превращающего фермента 8
1.2. Структура ангиотензин-превращающего фермента 10
1.3. Взаимное функционирование доменов в составе соматического ангиотензин-превращающего фермента 12
1.4. Трехмерная структура доменов ангиотензин-превращающего фермента
1.4.1. Структура С-домена 17
1.4.2. Структура N-домена 19
1.4.3. Сравнение строения активных центров N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента 21
1.4.4. Структура двудоменного фермента 24
2. Ингтібитор ангиотензин-превращающего фермента 31
2.1. Ограничения современных ингибиторов АИФ 31
2.2. Домен-селективные ингибиторы АИФ
2.2.1. N-домен специфичные ингибиторы 35
2.2.2. С-домен специфичные ингибиторы 36
2.3. Двойные ингибиторы АИФ и ЭПФ 38
3. Моноклональные антитела 42
3.1. Общая характеристика антител и антигенов 42
3.2. Исследование структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител кТЧ-домену
3.2.1. Исследование возможной связи между димеризацией и шеддингом ангиотензин-превращающего фермента с поверхности клеточных мембран 47
3.2.2. Исследование каталитической активности N-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител 49
3.2.3. Изучение конформационных изменений соматического ангиотензин-превращающего фермента при взаимодействии с ингибиторами 50
3.3. Исследование структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента с
помощью моноклональных антител к С-домену 51
Экспериментальная часть 56
4. Материалы и методы исследования 56
4.1. Материалы 56
4.2. Методы
4.2.1. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента 58
4.2.2. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента 58
4.2.3. Получение N-домена соматического ангиотензин-превращающего фермента 59
4.2.4. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента 59
4.2.5. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента 59
4.2.6. Подготовка пула плазмы крови 61
4.2.7. Подбор оптимальных концентраций фермента и моноклональных антител для иммуносорбции 63
4.2.8. Определение констант связывания моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающимферментом 63
4.2.9. Изучение влияния ингибиторов АПФ на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом
4.2.10. Определение влияния модификаторов на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом 65
4.2.11. Моделирование разрывов дисульфидных мостиков в N-домене ангиотензин-превращающего фермента 66
4.2.12. Влияние гемолиза на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом крови 66
4.2.13. Статистическая обработка результатов 67
Результаты и обсуждение 68
5. Определение эффективности связывания моноклональных антител с ангиотензин превращающим ферментом человека 68
5.1. Подбор оптимальных условий для иммуносорбции 68
5.2. Определение констант диссоциации комплексов моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом 70
5.3. Определение эффективности связывания панели моноклональных антител с различными формами соматического ангиотензин-превращающего фермента 71
6. Определение влияния ингибиторов на эффективность связьюания моноклональных антител с ангттотензин-превращающим ферментом человека 74
6.1. Выбор условий отмывки планшетов при иммуносорбции 74
6.2. Определение влияния эналаприлата и тепротида на связывание панели моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из крови 78
6.3. Анализ взаимного влияния доменов при связывании ингибиторов в активных центрах соматического ангиотензин-превращающего фермента 88
7. Определение влияния эффекторов на эффективность связьюания моноклональных антител с ангттотензин-превращающим ферментом человека 93
7.1. Определение влияния S-S восстанавливающих агентов на связывание панели моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из крови 93
7.2. Влияние восстановления дисульфидных связей на конформационную изменчивость ангиотензин-превращающего фермента под действием ингибиторов фермента 100
8. Иммунохимическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента в крови пациентов с уремией 106
8.1. Анализ связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в норме и при развитии уремии 106
8.2. Анализ ответа конформационно измененного ангиотензин-превращающего фермента на связывание ингибиторов АПФ при развитии уремии 111
8.3. Частота встречаемости конформационно измененного ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови условно здоровых доноров 121
Выводы 125
Список литературы 126
