Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Характеристика и свойства эмбриональных стволовых (ЭС) клеток
1.1.1. Получение ЭС клеток 12
1.1.2. Клеточный цикл 19
1.1.3. Дифференцировка ЭС клеток в культуре 19
1.1.4. Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре 24
1.1.5. Генетические модификации ЭС клеток 37
1.1.6. Моделирование эмбрионального развития с использованием ЭС клеток 38
1.2. Семейство TRIM белков
1.2.1. Характеристика семейства TRIM белков 47
1.2.2. Три основные группы белков TRIM семейства 49
1.2.3. Ген pub — представитель семейства TRIM белков 54
1.2.4 .Строение и свойства белка Pub 55
1.2.5. Возможные функции белка Pub . 58
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Культивирование клеток млекопитающих
2.1.1. Культивирование ЭС клеток 61
2.1.2. Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши 61
2.1.3. Культивирование клеток Rat-2 64
2.1.4. Культивирование лини клеток феохромацитомы крысы PC-12 64
2.1.5. Культивирование клеток человека Jurkat 64
2.2. Плазмиды, использованные в работе
2.2.1. Плазмиды pcDNA3, plneo, pPB, pRNAi, использованные для трансфекции ЭС клеток 65
2.2.2. Плазмиды pEJ6.6, pBR322 использованные для трансфекции клеток Rat-2 66
2.2.3. Плазмиды k-pub-myc, pub-myc, использованные для трансфекции ЭС клеток 67
2.3. Трансфекции клеток млекопитающих 2.3.1. Трансфекция ЭС клеток методом электропорации и последующая селекция 68
2.3.2. Трансфекция ЭС клеток с помощью липофектамина 68
2.3.3. Трансфекция и селекция псевдонормальной крысиной линии клеток Rat-2 69
2.3.4. Трансфекция клеток РС-12 69
2.4. Анализ пролиферации трансфицированных ЭС клеток 70
2.5. Индукция дифференцировки ЭС клеток с образованием ЭТ 70
2.6. Выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции 70
2.7. Полимеразная цепная реакция 72
2.8. Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих 73
2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 74
2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения 74
2.11. Иммуноблотинг 74
2.12. Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты 74
2.13. Иммуноцитохимический анализ 75
2.14. Индукция дифференцировки стабильно-трансфицированных клеток РС-12 под действием ФРН 75
2.15. Статистическая обработка результатов экспериментов 76
Глава 3. Результаты и их обсуждения
3.1. Экспрессия эндогенного в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1 и ЭТ 77
3.2. Получение трансфицированных линий ЭС клеток с повышенной экспрессией гена человека hpub, гена мьшшриЬ, а также с пониженной экспрессией гена мыта pub 78
3.2.1. Изучение пролиферативной активности трансфицированных линий. 82
3.3. Оценка онкогенного потенциала гена человека hpub 89
3.4. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гєпариЬ на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши 92
3.4.1. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на энтодермальную дифференцировку 94
3.4.2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на мезодермальную дифференцировку 96
3.4.3. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена, pub на эктодермальную дифференцировку 103
3.5. Влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку линии клеток феохромацитомы крысы PC-12 107
3.6. Возможный механизм влияния экспрессии генов pub и hpub на процессы дифференцировки ЭС клеток 113
Выводы 116
Список литературы
