Введение
1. Обзор литературы
1.1. Структура нуклеосом и подходы к её изучению 9
1.1.1. Топография гистонов и ДНК в составе корчастиц . 9
1.1.2. Структурные различия и роль в поддержании структуры ДНП 19
1.1.2.1. Общие закономерности строения гистонов - наличие двух структурно различных частей молекул 19
1.1.2.2. Функциональная роль w - и С-кон-цевых доменов молекул гистонов в составе ДШ 22
1.2. Хроматин низших эукариотических организмов. 31
1.2.1. Гистоны низших эукариотических организмов 32
1.2.2. Нуклеосомная организация хроматина низших эукариотов 47
1.2.2.1. Вариабельность длины нуклеосом-ного повтора ДНК 48
1.2.2.2. Некоторые особенности структуры хроматина дрожжей 54
1.3. Краткие выводы и постановка экспериментальных задач 64
2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Объект исследования 68
2.2. Выращивание Neurospora crassa 68
2.3. Препаративные методы 69
2.3.1. Выделение кор-частиц хроматина из Neurospora crassa 69
2.3.1.1. Получение препарата ядер 69
2.3.1.2. Контроль чистоты и целостности препарата ядер 70
2.3.1.3. Получение препарата хроматина 71
2.3.1.4. Выделение кор-частиц хроматина 71
2.3.2. Выделение кор-частиц из эритроцитов курицы 72
2.3.2.1. Получение препарата ядер из эритроцитов курицы 72
2.3.2.2. Получение препарата хроматина, лишенного гистонов НІ и Н5 73
2.3.2.3. Выделение кор-частщ 74
2.3.3. Обработка кор-частщ трипсином 75
2.3.4. Обработка кор-частщ дезоксирибонуклеазой 75
2.3.5. Получение меченных 32Р кор-частщ 76
2.3.6. Препаративный электрофорез ДНІ 76
2.3.7. Выделение суммарного препарата гистонов из Neurospora crassa
2.3.8. Фракционирование суммарных препаратов гистонов 78
2.3.9. Очистка гистонов В2В 79
2.4. Электрофоретические методы исследования 79
2.4.1. Приготовление образцов ДНК для электрофореза 79
2.4.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 80
2.4.3. Определение длины нуклеосомного повтора методом электрофореза ДНК в агарозном геле 81
2.4.4. Электрофорез ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях. 81
2.4.5. Высокоразрешащий электрофорез ДЕК в ПАЯ1 82
2.4.5.1. Проведение электрофореза 82
2.4.5.2. Авторадиографирование геля 84
2.4.6. Приготовление образцов белка для электрофореза 84
2.4.7.Диск-электрофорез гистонов в присутствии додецилсульфата натрия 85
2.4.8.Электрофорез гистонов в блоке ПААГ в присутствш мочевины 87
2.4.9.Двумерный электрофорез гистоновв ПАЯ1 88
2.5. Аналитические методы исследования 89
2.5.1.Определение количественного с одержання ДНК в материале 89
2.5.2.Количественное определение содержания белка. 89
2.5.3.Седашентационный анализ 90
2.5.4.Определение аминокислотного состава белков и пептидов 90
2.5.5.Определение и -концевых аминокислот белков и пептидов 91
2.5.5.1. Дансилирование белков и пептидов 91
2.5.5.2. Тонкослойная хроматография дансильных производных аминокислот. 95
2.5.6. Определение С-концевых аминокислот белка 93
2.5.7.Гидролиз гистона Б2В трипсином 93
2.5.8.Метод пептидных карт в тонком слое целлюлозы 94
2.5.9.Эволюция пептидов с целлюлозы 95
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Выделение кор-частиц хроматина из плесневого гриба Neurospora crassa 96
3.1.1. Выделение препарата хроматина из Neurospora qfi crassa
3.1.2. Электросборетические исследования белков тпт хроматина из N;!crassa
3.1.3. Нуклеосомная организация хроматина N.crassa 104
3.1.4. Получение препарата кор-частиц гриба 107
3.2. Характеристика выделенного препарата кор-частиц из Neurospora crassa 108
3.2.1. Электрофоретическое исследование белков препарата кор-частиц 111
3.2.2. Определение коэффициента седиментации препарата кор-частиц хроматина из Neurospora crassa 113
3.2.3. Чувствительность выделенного препарата корчастиц к действию ДНКазы I 115
3.3. Исследование процесса ограниченного протеолиза кор-частиц из Neurospora crassa 117
3.3.1. Электрофретическое исследование гистонов протеолизованных кор-частиц 118
3.3.2. Исследование влияния ионной силы раствора на скорость седиментации интактных и про те олизованных кор-частиц. 126
3.4. Исследование особенностей первичной структуры В2В Neurospora crassa 129
3.4.1. Выделение суммарного препарата гистонов Neurospora crassa 129
3.4.2. Фракционирование суммарного препарата гис-тонов 131
З.4.3. Аминокислотный, N- и С-конце вой анализ препарата гис тона Н2В N. crassa 134
3.4.4. Сравнительное изучение структуры гистонов В2В N.crassa и тимуса теленка методом пептидных карт 137
3.4.4.1. Двумерное разделение продуктов триптического гидролиза гистонов Б2В в тонком слое целлюлозы 137
3.4.4.2. Изучение аминокислотного состава и N -концевых аминокислот триптических пептидов Б2В из N.!crassa и тимуса теленка 145
3.5. Изучение продуктов гидролиза нуклеосомной ДНК дезоксирибонуклеазой 1-е помощью высокоразрешающего электрофореза 151
3.6. Краткое обсуждение полученных результатов 155
Выводы 163
