Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1. Продуценты ь -амилазы 10
2. Выделение и очистка бактериальной ь-амилазы 11
3. Методы, основанные на специфической сорбции амилаз крахмалом 17
4. .Физико-химические свойства бактериальных л-амилаз 24
5. Возможности практического применения -амилазы 24
ГЛАВА II. Экспериментальная часть - 31
1. Культивирование Bacillus polymyxa 3 31
2. Очистка -амилазы 32
2.1. Получение технического препарата -амилазы 32
2.2. Получение высокоочищенного препарата -амилазы 32
2.2.1. Разработка состава сорбента 32
2.2.2. Разработка условий сорбции-десорбции 33
а) сорбционная емкость кукурузного крахмала 33
б) геометрия колонки 33
в) температура сорбции и десорбции 33
г) условия десорбции: рН и концентрация ИаС1 в растворе 33
2.2.3. Очистка -амилазы методом специфической сорбции на крахмале 34
2.2.4. Очистка А-амилазы методом осаждения комплекса фермент-субстрат 34
2.2.5. Обессоливание растворов уь-амилазы методом гель-фильтрации 35
2.2.6. Концентрирование растворов а-амилазы 35
2.2.7. Изоэлектрическое фокусирование 35
3. Анализ продуктов гидролиза крахмала 36
3.1. Бумажная хроматография 36
3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 36
4. Методы определения ферментативной активности 37
4.1. Определение амилолитической активности 37
4.2. Определение протеолитическбй активности 38
5. Определение концентрации белка 38
6. Изучение свойств fe-амилазы 39
6.1. Определение молекулярной массы 39
6.1.1. Диск-электрофорез в присутствии додецил- сульфата натрия 39
а) окрашивание гликопротеидов 40
6.1.2. Седиментационный анализ 40
6.2. Определение аминокислотного состава 41
6.3. Определение карбогидратов 42
6.4. Изучение зависимости активности /6-амилазы от рН и температуры 42
6.5. Изучение стабильности ь-амилазы 42
6.6. Определение Км эфф 43
6.7. Изучение субстратной специфичности 43
7. Реагенты 43
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 44
1. Получение технического препарата fc-амилазы . 44
2. Получение высокоочищенного препарата 46
2.1. Разработка состава сорбента 46
2.2. Условия сорбции-десорбции--амилазы 50
2.3. Очистка бактериальной ь-амилазы 57
2.4. Изоэлектрическое фокусирование 65
3. Свойства изоформ -амилазы 70
3.1. Гомогенность и молекулярная масса 71
3.2. Аминокислотный состав 73
3.3. Углеводный состав 75
3.4. Влияние рН на активность и стабильность 75
3.5. Влияние температуры на активность и стабильность 78
3.6. Субстратная специфичность и продукты гидролиза 81
Выводы 88
Список литературы 90
