Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1 Целентеразин-зависимые люциферазы: модифицированные варианты для биоаналитического применения 11
1.1 Создание целентеразин-зависимых люцифераз с улучшенными физико химическими свойствами 12
2.1 Способы дискриминации аллеля 23
2.1.1 Удлинение праймера 23
2.1.2 Лигирование 26
2.1.3 Ферментативное расщепление 28
2.1.4 Гибридизация 30
2.2 Методы идентификации аллель-специфических продуктов 32
2.2.1 Флуоресцентная детекция 35
2.2.1.1 Флуоресцентный резонансный перенос энергии 36
2.2.1.2 Флуоресцентная поляризация 37
2.2.2 Хемилюминесцентная и биолюминесцентная детекция 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1 Вещества и реактивы 47
2.2 Буферные растворы и среды 48
2.3 Сайт-направленный мутагенез вариантов обелина 49
2.4 Приготовление компетентных клеток E. сoli XL1-Blue и BL21(DE3) Codon Plus (RIPL) и их трансформация плазмидной ДНК 50
2.5 Выделение плазмидной ДНК 50
2.6 Культивирование клеток E. сoli, выделение и очистка белков 51
2.7 Определение удельной биолюминесцентной активности и спектральные измерения 52
2.8 Химический синтез коньюгатов фотопротеинов с другими белками или олигонуклеотидами 54
2.9 Выделение геномной ДНК 55
2.10 Получение контрольных образцов плазмидной ДНК для одновременного анализа полиморфизмов гена МС1R 55
2.11 Одновременный биолюминесцентный анализ двух аллелей в одной лунке для генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов 2.11.1 ПЦР-амплификация фрагмента гена МС1R 57
2.11.2 Мультиплексная ПЦР для амплификации участков 4 разных генов 57
2.11.3 Реакция удлинения аллель-специфического праймера (PEXT реакция) 58
2.11.4 Биолюминесцентный анализ продуктов РЕXT реакции 59
2.12 Статистическая обработка результатов генотипирования полиморфизмов гена MC1R 60
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 62
3.1 Получение мутантных вариантов Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина для сайт-специфического конъюгирования 62
3.1.1 Одновременный биолюминесцентный анализ по выявлению однонуклеотидных полиморфизмов 71
3.2 Одновременное генотипирование четырех однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с факторами риска нарушений гемостаза 74
3.3 Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов в гене МС1R одновременным биолюминесцентным анализом 81
3.3.1 Характеристика исследуемой группы 83
3.3.2 Биолюминесцентный анализ полиморфизмов гена МС1R 83
3.3.3 Ассоциация вариантов гена MC1R с меланомой 85
3.3.4 Ассоциация вариантов MC1R и фенотипических характеристик 87
3.3.5 Ассоциация комбинированных вариантов гена MC1R с клинико морфологическими и фенотипическими характеристиками 91
Заключение 94
Выводы 96
Список цитируемой литературы
