Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1. Биологические свойства С. burnetii 11
2. Характеристика генома С. burnetii 16
3. Методы идентификации и дифференциации коксиелл: биологические, серологические, иммунологические, молекулярно-биологические 24
I. Методы идентификации 24
Методы культивирования С. burnetii 24
Биологические методы идентификации 25
Серологические методы 26
Молекулярно-генетические методы 27
ПЦР в формате реального времени 29
II. Методы дифференциации С. burnetii и оценка генетической однородности мировой популяции коксиелл 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
1. Материалы 37
1.1. Штаммы С. burnetii 37
1.2. Биологический материал 42
1.3. ДНК микроорганизмов для контроля специфичности реакций ПЦР и ПЦР-РВ 43
2. Методы 43
2.1. Культивирование С. burnetii для накопления биомассы 43
2.1.1. Культивирование на куриных эмбрионах 43
2.1.2. Культивирование в культуре клеток 44
2.2. Очистка от тканевых примесей 44
2.3. Подсчет количества клеток С. burnetii в материале 45
2.4. Выделение ДНК 46
2.5. Дизайн праймеров 47
2.6. Полимеразная цепная реакция 49
2.7. Электрофорез в агарозном геле 50
2.8. ПЦР в формате реального времени 50
2.9. Выделение ДНК из агарозного геля 51
2.10. Рестрикция 52
2.11. Секвенирование 52
2.12. Статистическая и компьютерная обработка данных 53
II. Результаты 54
ГЛАВА 3. Оптимизация пцр для выявления с. burnetii ъ полевом и клиническом материале 54
ГЛАВА 4. Сравнительная эффективность технологий пцр-рв sybrgreen iи пцр-рв taqman для выявления и оценки количественного содержания с. burnetii ъ образцах биологического материала 65
1. ПЦР-РВ, технология SYBRGreen 1 66
2. ПЦР-РВ, технология TaqMan 72
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов с. burnetii 78
1. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции 78
2. Мультиспейсер-типирование 81
3. Распределение штаммов по типу плазмид и типу сиквенса генов djIA и соті 93
Заключение 96
Выводы 102
Список литературы 104
