Введение
ГЛАВА 1. Биоэлектрохимическое окисление углеводов и спиртов уксуснокислыми бактериями gluconobacter oxydans 18
1.1. Потенциал бактерий Gluconobacter как биокатализаторов при разработке медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов: обоснование выбора объекта исследований 18
1.1.1. Физиолого-биохимические особенности уксуснокислых бактерий рода Gluconobacter 18
1.1.1.1. Особенности дыхательной цепи 20
1.1.1.2. Метаболизм углеводов и спиртов 23
1.1.1.3. Характеристика мембранных дегидрогеназ 26
1.1.2. Биоэлектрохимические системы на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter. обзор разработанных устройств и подходов к их созданию
1.1.2.1. Биосенсоры на основе Gluconobacter 37
1.1.2.2. Микробные топливные элементы на основе Gluconobacter 41
1.2. Восстановление искусственных акцепторов электронов ферментными системами целых клеток Gluconobacter 44
1.2.1. Редокс-красители для определения их метаболической активности микроорганизмов: обоснование методики исследования 44
1.2.2. Конкуренция кислорода и искусственных акцепторов за электроны мембранных оксидоредуктаз Gluconobacter oxydans 49
1.2.3. Эффективность искусственных акцепторов электронов при окислении глюкозы бактериями Gluconobacter oxydans
1.2.4. Анализ субстратной специфичности бактерий Gluconobacter oxydans при взаимодействии с искуссвенным акцептором электронов... 58
1.2.5. Сравнительная характеристика целых клеток Gluconobacter oxydans и их ферментных фракций как биокатализаторов окисления глюкозы и этанола в присутствии искусственных акцепторов электронов 61
1.3. Анализ процессов биоэлектрохимического окисления субстратов
уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans (медиаторный
биоэлектрокатализ) 65
1.3.1. Оценка возможности использования редокс-соединений как медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий Gluconobacter oxydans методом вольтамперометрии 69
1.3.2. Субстратная специфичность бактерий Gluconobacter oxydans в условиях биоэлектрохимического окисления при участии медиаторов электронного транспорта 77
1.3.3. Моделирование процессов электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans 1.3.3.1. Скоростьопределяющие стадии окисления субстратов иммобилизованными на поверхности электрода бактериями в условиях функционирования медиаторного биосенсора 82
1.3.3.2. Биоэлектрокаталитическое окисление субстратов в системах с иммобилизованными бактериями - механизм «пинг-понг». Эффективность медиаторов 92
ГЛАВА 2. Иммобилизованные микроорганизмы -деструкторы капролактама как биораспознающие элементы биосенсоров
2.1. Методы анализа капролактама в водных средах и биохимические основы деградации капролактама и его олигомеров (обзор): отправные точки для исследования
2.1.1 Физико-химические методы определения є-капролактама в водных средах 114
2.1.2. Биодеградация капролактама и олигомеров аминокапроновой кислоты 115
2.1.2.1. Биохимические и генетические аспекты катаболизма капролактама 115
2.1.2.2. Ферменты деградации нейлоновых олигомеров
2.2. Скрининг бактерий с различными сочетаниями «САР-плазмида -бактериальный хозяин» по окислительной активности 125
2.3. Трансформация линейных олигомеров є-аминокапроновой кислоты бактериями-деструкторами капролактама
2.3.1. Дыхательная активность бактерий-деструкторов капролактама в присутствии олигомеров 135
2.3.2. Трансформация олигомеров бактериями-деструкторами капролактама: масс-спектрометрическое исследование 137
3.3.1. со-Трансаминазная активность бактерий в присутствии 6-аминогексаноата и димера 6-аминогексаноата 145
ГЛАВА 3. Биосенсоры для экологического мониторинга . 149
3.1. Микробные биосенсоры в экотоксикологии: принципы
функционирования и практическое применение (обзор) 150
3.1.1. Биосенсоры для оценки токсичности среды и определения токсикантов 150
3.1.2. БПК-биосенсоры 157
3.2. Микробный сенсор для мониторинга содержания капролактама в стоках 163
3.2.1. Макет микробного сенсор кюветного типа для детекции капролактама 164
3.2.2. Макет биосенсора проточно-инжекционного типа
3.3. Микробный биосенсор и методика для оценки токсичности продукции бытового назначения 176
3.4. Медиаторные биосенсоры на основе уксуснокислых бактерий и выделенных из них мембранных фракций для определения суммарного содержания Сахаров, спиртов и БПК 194
3.4.1. Микробный медиаторный биосенсор 195
3.4.1.1. Выбор рабочих параметров функционирования микробных сенсоров 195
3.4.1.2. Долговременная и операционная стабильность микробных медиаторных биосенсоров 197
3.4.2. Медиаторный биосенсор на основе мембранных фракций бактерий
199
3.4.2.1. Выбор рабочих параметров функционирования медиаторного биосенсора на основе мембраной фракции бактерий Gluconobacter oxydans 199
3.4.2.2. Долговременная и операционная стабильность медиаторных биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans 201
3.4.3. Характеристики макетов БПК-биосенсоров 203
ГЛАВА 4. Материалы и методы 206
4.1. Реактивы и материалы 206
4.2. Биокатализаторы как основа биораспознающих элементов биосенсоров: штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования, буферные растворы, ферментные фракции бактерий..
4.2.1. Штаммы микроорганизмов 206
4.2.2. Среды и условия культивирования микроорганизмов 207
4.2.3. Буферные растворы
4.2.4. Выделение ферментных структур бактерий Gluconobacter oxydans
4.3. Взаимодействие искусственных акцепторов электронов с уксуснокислыми бактериями 210
4.3.1. Дегидрогеназная активность ферментных фракций бактерий 211
4.3.2. Скорости восстановления редокс-красителей целыми клетками бактерий 211
4.4. Амперометрические методы регистрации окислительной активности
иммобилизованного биоматериала 212
4.4.1. Биоэлектрохимические системы с медиаторным переносом электронов 212
4.4.2. Регистрация дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов капролактама с помощью амперометрического кислородного датчика 214
4.5. Методы определения капролактама и степени его деградации 218
4.5.1. Тонкослойная хроматография растворов капролактама 218
4.5.2 Фотометрический метод определения капролактама 218
4.5.3. Газохроматографическое определение капролактама 219
4.5.4. Определение концентрации капролактама в образцах промышленных отходов 219
4.5.5. Оценка степени биодеградации капролактама в образцах
промышленных отходов 219
4.6. Масс-спектрометрический анализ биодеградации олигомеров 6-аминогексановой кислоты 220
4.7. Трансаминазная активность 221
4.8. Оценка токсичности образцов бытовой продукции
4.8.1. Пробоподготовка образцов продукции бытового назначения 222
4.8.2. Дыхательная активность микроорганизмов как тест-функция для оценки токсичности 2 4.8.3. Референтные методы для гигиенической оценки продукции
бытового назначения по химическому фактору 224
4.9. Определение БПК5 модельных и реальных образцов 225
4.9.1. Стандартный метод разбавления 225
4.9.2. Моделирование процесса спиртового брожения 225
Заключение 226
Выводы 229
Благодарности
