Введение
1. Влияние структуры РНК на термодинамику и кинетику её взаимодействия с олигонуклеотидами 11
1.1. Введение 11
1.2. Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК 12
1.3. Термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с РНК 16
1 3.1. Влияние структуры РНК на взаимодействие с комплементарными олигонуклеотидами 16
1.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК 24
1.4. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с РНК 29
1.5. Теоретические подходы расчета сродства олигонуклеотидов к структурированным участкам РНК 38
1.6. Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням 41
2. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК: кинетические термодинамические и структурные аспекты 48
2.1. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с дрожжевой фенилаланиновой тРНК 48
2.1.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов. 48
2.1.2. Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК 50
2.1.3. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с тРНК 61
2.2. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171 -звенным фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю 69
2.2.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов 69
2.2.2. Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК 72
2.2.3. Обсуждение данных по взаимодействию олигонуклеотидов с фрагментом ECAS171 РНК 78
2.3. Взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК гена MDR 1 человека 82
2.3.1. Идентификация в структуре 5-концевого фрагмента MDR 1 мРНК сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов 82
2.3.2. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом MDR 1 РНК 91
2.3.3. Применение бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для детекции ДНК в растворе 109
2.4. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с РНК 111
2.4.1. Гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКР|,е 111
2.4.2. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с методов остановленной струи 119
2.4.3. Определение параметров Еа, АН и AS процесса гибридизации олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Механизм гибридизации. 128
2.5. Сильно-связывающиеся аналоги олигонуклеотидов (SB-ON) - путь увеличения эффективности гибридизации олигонуклеотидов с РНК 133
2.5.1. Сравнение взаимодействия SB-ONs с TPHKPhe из дрожжей с немодифицированными олигонуклеотидами 133
2.5.2. Гибридизация SB-ONs с тРНК*5116 в присутствии ионов магния 139
2.5.3. Определение минимального размера SB олигонуклеотида, способного связываться с тРНК6 140
3. Взаимодействие олигонуклеотидов с рнк in vitro в культуре клеток 145
3.1. Обращение р-гликопротеин опосредованной множественной лекарственной устойчивости (PGY/MDR1) с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и рибозимов 145
3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с MDR1 мРНК in vitro в культуре клеток 169
3.2.1. Выбор модели 169
3.2.2. Производные олигонуклеотидов, использованные для ингибирования экспрессии MDR 1 мРНК в клетках линии КВ-8-5 171
3.2.3. Метод тестирования внутриклеточной активности олигонуклеотидов 172
3.2.4. Ингибирование экспрессии MDR 1 мРНК в клетках КВ-8-5 антисмысловыми олигонуклеотидами 174
3.3. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток 179
4. Взаимодействие рнк с химическими рибонуклеазами 181
4.1. Расщепление РНК конъюгатами 1,4.-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола 181
4.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз 181
4.1.2. РНК модели и схема эксперимента 182
4.1.3. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз 183
4.1.3.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 183
4.1.3.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность ее расщепления соединениями ABL3Cm 189
4.1.3.3. Влияние концентрации искусственных рибонуклеаз на скорость расщепления РНК 191
4.1.3.4. Кинетика расщепления РНК химическими рибонуклеазами ABL3Cm 194
4.1.4. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 202
4.1.4.1. Влияние природы буфера на эффективность расщепления РНК 202
4.1.4.2. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 204
4.1.5. Механизм расщепления рнк под действием химических рибонуклеаз 205
4.1.5.1. Определение продуктов, образующихся в месте расщепления РНК соединениями ABL3Cm 205
4.1.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями ABL3Cm 208
4.1.5.3. Определение сродства соединений ABL3Cm к РНК 209
4.1.5.4. Доказательство каталитического характера расщепления РНК под действием соединений ABL3Cm 210
4.2. Применение искусственных рибонуклеаз для исследований структуры РНК в растворе 212
4.2.1. Пробинг вторичной структуры митихондриальных тРНК*"1" дикого Tnna(Kwt) и содержащей замену (А9->С) (Krw) 212
4.2.2. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа 216
4.3. Расщепление РНК с помощью конъюгатов пептида [LeuArg]4-Gly-NH2 и олигонукпеотидов со случайной последовательностью 223
4.3.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и РНК-мишени 223
4.3.2. Эффективность и специфичность расщепления РНК олигонуклеотид- пептидными конъюгатами 224
4.3.3. Контроль специфичности расщепления РНК 234
4.3.4. Исследование возможности взаимодействия между РНК и олигонуклеотидом в составе конъюгата 235
4.3.5. Определение кинетических параметров расщепления РНК конъюгатами рер-Л, рер-7 и рер-16 237
4.3.6. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК 245
4.3.7. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления 247
4.3.8. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 248
4.3.9. Природа специфичности к последовательности РНК олигонуклеотид- пептидных конъюгатов 253
4.3.10. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК 255
5. Направленная модификация или расщепление РНК с помощью реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов 258
5.1. Сайт-направленная модификация лидерной области thrS мРНК с помощью алкилирующих производных антисмысловых олигонуклеотидов 258
5.2. Сайт-направленная модификация фрагмента MDR1 мРНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с блеомицином, фталоцианином и перфторарилазидом 267
5.2.1. РНК-мишень и конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов 267
5.2.2. Исследование специфичности связывания олигонуклеотидов и конъюгатов с РНК190 270
5.2.3. Реакции фрагмента MDR1/PGY1 м РНК и ДНК с конъюгатами олигонуклеотидов 271
5.2.4. Обсуждение результатов 277
5.3. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом 280
5.3.1. Исследование взаимодействия конъюгата рер-1 А с тРНК^з 281
5.3.2. Рибонуклеазная активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 285
5.3.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению РНК олигонуклеотид-пептидным конъюгатом 290
5.4. Направленное расщепление РНК с помощью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями 293
5.4.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов и выбор РНК-мишени 294
5.4.2. Направленное расщепление тРНК" конъюгатами олигонуклеотидов, содержащими моно- и бис-имидазольные конструкции, полученными методом постсинтетической модификации 295
5.4.3. Направленное расщепление тРНК"1* конъюгатами олигонуклеотидов, несущими дендримерные имидазолсодержащие конструкции 304
5.4.4. Заключение 324
6. Экспериментальная часть 327
Выводы 361
