Введение
Глава 1. Обзор литературы. Малая ГТФаза Arf6. 21
1.1. Общая характеристика белков семейства Arf 21
1.2. Структура и механизмы функционирования белков Arf 23
1.3. Механизмы регуляции Arf6. Белки GEF и GAP. 30
1.4. Функции Arf6 в клетке. 38
1.4.1. Метаболизм фосфолипидов. 38
1.4.1.1. Arf6 активирует PIP5K, стимулируя образование PI(4,5)P2 38
1.4.1.2. Arf6 активирует PLD – фермент, продуцирующий ФК и активирующий mTOR . 40
1.4.1.3. Arf6 и другие липиды. 48
1.4.2. Arf6 и эндоцитоз. 49
1.4.2.1. Arf6 в клатрин-зависимом эндоцитозе 51
1.4.2.2. Arf6-зависимый клатрин-независимый эндоцитоз
1.4.3. Arf6 и рециклирование эндосом 54
1.4.4. Неспецифическое влияние Arf6 на мембранный транспорт
1.4.4.1. Изменение кривизны мембраны 55
1.4.4.2. Регулирование актинового цитоскелета
1.4.5. Arf6 и экзоцитоз 59
1.4.6. Arf6 в процессах миграции, инвазии и метастазирования. 61
Глава 2. Материалы и Методы
2.1. Клеточные линии 65
2.2. Выделение нуклеиновых кислот
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК 65
2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.3. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 67
2.4. Молекулярное клонирование
2.4.1. Получение компетентных клеток E. coli 67
2.4.2. Трансформация компетентных клеток E. coli 68
2.4.3. Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 68
2.4.4. Реакция лигирования 69
2.4.5. Клонирование предшественников малых шпилечных РНК 2.5. Трансфекция 70
2.6. Инфекция псевдовирусными частицами. 71
2.7. Анализ белков
2.7.1. Приготовление клеточных лизатов 72
2.7.2. Вестерн-блот гибридизация 73
2.7.3. Стимуляция ERK1/2 эпидермальным фактором роста 75
2.7.4. Анализ активности PLD 75
2.7.5. Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ 76
2.7.6. Анализ желатиназной активности 77
2.7.7. Анализ активности uPA 77
2.8. Исследование клеточных характеристик in vitro 78
2.8.1. Анализ динамики роста клеток 78
2.8.2. Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность) 78
2.8.3. Выделение ядер клеток и проведение исследования клеточного цикла на проточном цитофлуориметре 78 2.9. Статистическая обработка результатов 79
2.9.1. Денситометрия 79
2.10. Растворы, реагенты и среды 79
Глава 3. Результаты 83
3.1. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию и активность белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией, в клетках глиобластомы человека 84
3.1.1. Выбор основной экспериментальной модели. 84
3.1.2. Получение производных клеточных линий глиобластомы человека с продукцией экзогенного белка Arf6 86
3.1.3. Подавление экспрессии гена Arf6 в клетках линий глиобластомы человека LN229 и U87 при помощи малых шпилечных РНК (shRNA) 88
3.1.4. Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток глиобластомы 90
3.1.4.1. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (тест на клоногенность) 91
3.1.5. Роль малой ГТФазы Arf6 в активации mTOR-зависимого сигнального пути 94
3.1.5.1. Участие малой ГТФазы Arf6 в активаци mTORС1-S6К в клетках полученных производных линий глиобластомы 94
3.1.5.2. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активность других эффекторов сигнального пути протеинкиназы mTOR 96
3.1.5.2.1 Влияние малой ГТФазы Arf6 на фосфорилирование рибосомального белка S6 в клетках глиобластомы. 96
3.1.5.2.2. Влияние малой ГТФазы Arf6 на фосфорилирование белка 4E-BP1 в клетках глиобластомы 99
3.1.5.3. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активность фосфолипазы D в клетках глиобластомы. 102
3.1.5.4. Анализ влияния гиперэкспрессии белка Arf6 на активацию Akt 104
3.1.6. Анализ влияния Arf6 на статус фосфорилирования MAP-киназы ERK1/2 в клетках глиобластомы 105
3.1.6.1. Определение уровня фосфорилирования ERK1/2 при стимуляции эпидерамальным фактором роста (EGF) 105
3.1.6.2. Анализ статуса фосфорилирования MAP-киназы p38 в клетках глиобластом при модуляции экспрессии Arf6 108
3.1.6.3. Анализ активности секретируемых протеаз, ремоделирующих ВКМ, в клетках глиобластомы при модуляции экспрессии.. 111
3.1.6.4. Анализ клеточного цикла производных линий глиобластом при модуляции экспрессии Arf6 методом проточной цитофлуориметрии. 112
3.2. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток линий немелкоклеточного рака легкого 113
3.2.1. Получение производных клеточных линий НМРЛ A549 и H1299 с измененной экспрессией Arf6 113
3.2.2. Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток линий НМРЛ 115
3.2.2.1. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (тест на клоногенность) 117
3.2.3. Участие малой ГТФазы Arf6 в альтернативной активации протеинкиназы mTOR и S6-киназы (p70S6K) в клетках НМРЛ. 118
3.2.4. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активацию MAP-киназы ERK1/2 в клетках НМРЛ. 120
3.2.5. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активацию MAP-киназы p38 в клетках НМРЛ. 121
3.2.6. Анализ активности матриксных металлопротеиназ и активатора плазминогена урокиназного типа в клеточных линиях НМРЛ с гиперэкспрессией малой ГТФазы Arf6. 122
3.3. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток опухолей других гистологических типов 123
3.3.1. Получение производных трансформированных клеток человека различного гистогенеза с гиперэкспрессией 123
3.3.2. Анализ пролиферативного потенциала производных клеточных линий HT1080, A375, PANC-1 и MIA PaCa-2 с гиперэкспрессией малой ГТФазы Arf6. 124
Обсуждение результатов исследования 127
Выводы. 145
Список использованной литературы
