Введение
1. Оглавление.
1. Оглавление 2
1.1. Список использованных сокращений 5
2. Введение 6
2.1. Актуальность исследования 6
2.2. Цель работы 7
2.3. Задачи 7
2.4. Научная новизна работы 8
2.5. Научно-практическая ценность работы 9
2.6. Апробация работы 9
2.7. Личный вклад автора 10
2.8. Публикации 10
2.9. Структура и объём работы 11
3. Обзор литературы 13
3.1. Семейство СYP51 13
3.2. Физиологическая роль CYP51 14
3.3. Влияние структурной консервативности на функцию СYP51 17
3.4. Антиатеросклеротические препараты
3.4.1. Атеросклероз. Общие сведения 22
3.4.2. Медикаментозная терапия атеросклероза 24
3.5. Ингибиторы CYP. 26
3.5.1. Обратимые ингибиторы CYP. 27
3.5.2. Ингибирование CYP вследствие координации химических ангентов с атомом железа гема 27
3.5.3. Ингибирование CYP вследствие связывания химических агентов с атомом железа гема 28
3.5.4. Ингибирование CYP в случае одновременной координации низкомолекулярных соединений с гемом и связывания их с липофильными регионами молекулы белка-мишени 29
3.6. Ингибирование ферментов биосинтеза 32
3.6.1. Ингибиторы CYP11A1 32
3.6.2. Ингибиторы ароматазы 33
3.6.3. Ингибиторы стерол-14а-деметилазы (CYP51) 3.7. Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия лигандов с белком-мишенью 44
3.8. Метод поверхностного плазмонного резонанса 46
3.9. Метод спектрального титрования 3.10. Метод измерения активности CYP51A1 в востановленной системе цитохрома 52
3.11. Электрохимический метод поиска потенциальных ингибиторов цитохромов 54
4. Материалы и методы 57
4.1. Химические реактивы 57
4.2. Белки 57
4.3. Низкомолекулярные соединения 58
4.4. Поверхностный плазмонный резонанс
4.4.1. Подготовка оптического бисенсора к работе 65
4.4.2. Подбор иммобилизационного буфера 65
4.4.3. Приготовление экспериментальных образцов низкомолекулярных соединений для анализа межмолекулярных взаимодействий в оптическом биосенсоре 66
4.4.4. Иммобилизация CYP51 человека и Candida albicans на поверхности оптического чипа СМ5 66
4.4.5. Анализ способности низкомолекулярных соединений взаимодействовать с СYP51 человека и Candida albicans 67
4.4.6. Регистрация кинетических и термодинамических параметров взаимодействий низкомолекулярных соединений с СYP51 67
4.4.7. Обработка данных, полученный с помощью оптического биосенсора. 68
4.4.7.1. Рассчёт равновесной константы диссоциации 68
4.4.7.2. Расчёт термодинамических параметров взаимодействия низкомолекулярных соединений с CYP51A1 70
4.4.7.3. Оценка качества фитирования 71
4.5. Спектральное титрование 72
4.5.1. Расчёт константы диссоциации комплекса белка с низкомолекулярным соединением в экспериментах по спектральному титрованию 72
4.6. Биохимическое тестирование на способность низкомолекулярных соединений ингибировать CYP51A1 человека 73
5. Результаты и их обсуждение 75
5.1. Подбор иммобилизационного буфера 75
5.2. Иммобилизация CYP51A1 76
5.3. Анализ способности низкомолекулярных соединений взаимодействовать с CYP51 человека 77
5.4. Анализ аффинности взаимодействия низкомолекулярных соединений с CYP51A1 79
5.5. Анализ связывания низкомолекулярных соединений в активном центре CYP51A1 методом спектрального титрования 95
5.6. Биохимическое тестирование ингибирующего действия низкомолекулярных соединений наСУР51А1 97
5.7. Анализ термодинамических параметров взаимодействия низкомолекулярных соединений с иммобилизованным CYP51A1 98
5.8. Апробация разработанной тест-системы для анализа соединений, способных взаимодействовать с другими представителями семейства CYP51.1 6. Заключение 111
7. Выводы 113
8. Благодарности 115
9. Список литературы
