Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Растительная биомасса 10
1.2. Компонентный состав растительного сырья 11
1.3. Биотехнологическая переработка растительного сырья 14
1.3.1. Глубокая переработка растительного сырья 15
1.3.2.Ферментативный гидролиз растительного сырья 18
1.3.2.1. Ферменты целлюлолитического комплекса 19
1.3.2.2. Методы оптимизации процесса ферментативного гидролиза 21
1.4. Белковая инженерия целлюлаз 24
1.4.1. Основные направления белковой инженерии целлюлаз 25
1.4.2. Инженерия сайтов гликозилирования целлюлаз
1.4.2.1. Гликозилирование и его роль в структуре и функции целлюлаз 28
1.4.2.2. Инженерия сайтов N-гликозилирования целлюлаз 30
1.5. Целлюлолитический комплекс Penicillium verruculosum 31
1.5.1. Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum 31
1.5.2. Целлюлазы Penicillium verruculosum 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 34
2.1. Материалы 34
2.1.1. Микроорганизмы 34
2.1.2. Ферментные препараты 34
2.1.3. Субстраты 34
2.1.4. Реактивы 35
2.2. Методы 35
2.2.1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей 35
2.2.2. Моделирование трехмерных структур 36
2.2.3. Генная инженерия и микробиология
2.2.3.1. Амплификация и клонирование целевых генов 36
2.2.3.2. Трансформация штамма-реципиента Penicillium canescens 36
2.2.3.3. Культивирование грибных штаммов 37
2.2.3.4. Исследование внутриклеточной экспрессии
2.2.4. Выделение и очистка ферментов хроматографическими методами 38
2.2.5. Определение концентрации белка 38
2.2.6. Определение активности ферментов 38
2.2.7. Определение биохимических свойств ферментов 39
2.2.8. Определение гидролитической способности ферментов 40
2.2.9. Масс-спектрометрический анализ 41
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 42
3.1. Общая схема проведения экспериментов 42
3.2. Белковая инженерия эндоглюканазы II Penicillium verruculosum
3.2.1. Анализ аминокислотной последовательности ЭГII Penicillium verruculosum 45
3.2.2. Внесение мутаций в ген и получение плазмид 48
3.2.3. Получение грибных штаммов, продуцирующих мутантные формы ЭГII 48
3.2.4. Выделение и очистка ЭГII хроматографическими методами 53
3.2.5. Масс-спектрометрический анализ ЭГII 57
3.2.6. Анализ биохимических и каталитических свойств ЭГII 59
3.3. Белковая инженерия целлобиогидролазы II Penicillium verruculosum 70
3.3.1. Анализ аминокислотной последовательности ЦБГII Penicillium verruculosum 70
3.3.2. Внесение мутаций в ген и получение плазмид 73
3.3.3. Получение грибных штаммов, продуцирующих мутантные формы ЦБГII 74
3.3.4. Выделение и очистка ЦБГII хроматографическими методами 79
3.3.5. Масс-спектрометрический анализ ЦБГII 83
3.3.6. Анализ биохимических и каталитических свойств ЦБГII 84
3.4. Белковая инженерия целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum 94
3.4.1. Анализ аминокислотной последовательности ЦБГI Penicillium verruculosum 94
3.4.2. Внесение мутаций в ген и получение плазмид 97
3.4.3. Получение грибных штаммов, продуцирующих мутантные формы ЦБГI 98
3.4.4. Выделение и очистка ЦБГI хроматографическими методами 102
3.4.5. Масс-спектрометрический анализ ЦБГI 107
3.4.6. Анализ биохимических и каталитических свойств ЦБГI 109
3.4.7. Исследование внутриклеточной экспрессии ЦБГI 116
3.5. Гидролиз ЦСМ под действием смесей целлюлаз Penicillium verruculosum 120
3.5.1. Выбор условий проведения гидролиза 120
3.5.2. Гидролиз ЦСМ под действием смесей ЭГII, ЦБГII и ЦБГI Penicillium verruculosum 121
Заключение 139
Список литературы
