Введение
Обзор литературы 9
1. Основные принципы регуляции сокращения гладких мышц 9
1.1. Особенности структуры и регуляции гладкомышечного миозина 10
2. Механизмы регуляции фосфорилирования миозина 13
2.1. Киназа лёгких цепей миозина 13
2.1.1. Структура и свойства киназы лёгких цепей миозина 13
2.1.2. Регуляция киназы лёгких цепей миозина 15
2.2. Са2+-независимое фосфорилирование миозина 18
2.2.1. ZIP-киназа 21
2.3. Фосфатаза лёгких цепей миозина 27
2.3.1. Структура и свойства фосфатазы лёгких цепей миозина 27
2.3.2. Регуляция фосфатазы лёгких цепей миозина 29
3. KRP 31
3.1. Структура белка KRP и его свойства in vitro 32
3.2. Расслабление гладких мышц под действием KRP 34
3.3. Фосфорилирование KRP 36
4. Использование скинированных гладкомышечных волокон для исследования регуляции
сократительной активности 37
Цели и задачи 40
Материалы и методы 41
Материалы 41
Методы 44
1. Молекулярно-биологические методы 44
1.1. Получение химически компетентных клеток Е. СОІІ 44
1.2. Трансформация бактериальных клеток 44
1.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 45
1.4. Бактериальная экспрессия рекомбинантных белков 45
2. Биохимические методы 46
2.1 Определение концентрации белков 46
2.2. Приготовление образцов тканей для электрофореза 46 2.3. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли 47
2.4. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в присутствии мочевины и глицерина 2.6.1. Выделение тяжёлого меромиозина (НММ) 49
2.6.2. Выделение цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG) 51
2.6.3 Выделение рекомбинантного KRP человека (wt-hKRP и AC-hKRP) 52
2.6.4. Выделение рекомбинантного KRP курицы, содержащего С-концевой полигистидин (chiKRP-His6, AN-chiKRP-His6 и AC-chiKRP-His6 ) 53
2.6.5. Экспрессия и очистка GST-p44erkl МАР-киназы 2.7. Получение фрагмента КЛЦМ с массой 61 кДа 54
2.8. Фосфорилирование KRP in vitro и его очистка от протеинкиназ 56
2.9. Фосфорилирование НММ под действием КЛЦМ 58
3. Физиологические методы исследования 59
3.1. Получение препарата taenia coli, скинированного Тритоном Х-100 59
3.2. Измерение сократительной активности taenia coli 60
3.3. Измерение фосфорилирования KRP в волокнах в ходе сокращения, индуцированного
3.4. Измерение дефосфорилирования KRP в волокнах taenia coli 62
4. Конфокальная микроскопия волокон taenia coli 63
Результаты экспериментов 65
1. KRP ингибирует фосфорилирование НММ под действием киназы лёгких цепей миозина,
лишённой KRP-домена 65
2. KRP тормозит развитие сокращения, индуцированного микроцистином 68
3. Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его ингибиторный
3.1. Фосфорилирование не влияет на ингибиторную активность KRP в условиях in vitro 72
3.2. Фосфорилирование не влияет на способность KRP ингибировать сокращение,
4. Влияние РКА и PKG на развитие сокращения, индуцированного микроцистином 79
4.1. РКА и PKG не влияют на сокращение, индуцированное микроцистином 79
4.2. Фосфорилированный KRP не изменяет эффекта PKA/PKG на сокращение,
5. Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его способность расслаблять гладкие мышцы, сокращённые при субмаксимальной концентрации кальция 82
5.1. РКА, но не PKG вызывает расслабление скинированных волокон, сокращенных при
субмаксимальной концентрации кальция 83
5.2. KRP вызывает расслабление сокращённых при субмаксимальной концентрации кальция волокон, но действие KRP не зависит от его фосфорилирования 86
5.3. PKG не усиливает действия KRP 89
5.4. KRP не усиливает действия PICA 6. Влияние KRP на сенситизацию Са2+-сокращения, вызванную ингибированием фосфатазы миозина 93
7. Удаление С-концевой последовательности KRP приводит к потере его регуляторного эффекта на сократительную активность мышц
7.1. С-концевая, но не N-концевая последовательность необходима для ингибиторного действия KRP in vitro 96
7.2. С-концевая последовательность необходима для ингибиторного действия KRP в модели сокращения, индуцированного микроцистином 98
7.3. ACKRP не вызывает расслабления гладкомышечных волокон, предсокращенных под действием Са2+ 100
Обсуждение результатов 102
1. Гипотетический механизм ингибирования фосфорилирования РЛЦ миозина белком KRP
2. Роль KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц 105
3. Эффект KRP не регулируется фосфорилированием 108
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы
