Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика мембранных белков 11
1.2 Клеточные системы экспрессии рекомбинантных мембранных белков..13
1.3. Бесклеточные системы продукции мембранных белков 16
1.3.1. Источники экстрактов для бесклеточных систем - выбор оптимального варианта экспрессии мембранных белков 18
1.3.2. Компоненты и основные конфигурации бесклеточных систем на основе S30 экстракта E. сoli 20
1.3.3. Форматы бесклеточных систем для продукции мембранных белков...23
1.4. Структура и особенности функционирования Kv-каналов 29
1.4.1. Роль Kv-каналов в канцерогенезе 33
1.4.2. Бесклеточный синтез ионных каналов и их доменов 35
1.5. Пептидные и низкомолекулярные ингибиторы Kv-каналов 37
1.5.1. Формирование дисульфидных связей в клетках E.coli 49
1.5.2. Продукция белков с множественными дисульфидными связями в бесклеточных системах 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Материалы исследования 62
2.2. Методы исследования 63
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 72
3.1. Получение модельных полипептидов в бесклеточной системе экспрессии на основе S30 экстракта из E. coli 72
3.1.1. Дизайн ДНК матриц 72
3.1.2. Получение S30 экстракта из E. coli 75
3.1.3. Влияние концентрации ионов Mg2+ и K+ 76
3.1.4. Экспрессия ВСД-KvAP в присутствии детергентов (D-CF) 77
3.1.5 Экспрессия TRX-VSTX1 в растворимой форме 78
3.2. Выделение и очистка модельных полипептидов полученных в бесклеточной белоксинтезирующей системе 79
3.2.1 Растворение ВСД-KvAP из осадка реакционной смеси 79
3.2.2. Металл-хелатная аффинная хроматография ВСД-KvAP 80
3.2.3. Расщепление слитого белка TRX-VSTX1 81
3.3. Структурно-функциональная характеристика препаратов модельных полипептидов 82
3.3.1. Изучение молекулярно-массового распределения 82
3.3.2 Анализ вторичной структуры и термостабильности 83
3.3.3. ЯМР спектроскопия модельных полипептидов 85
3.3.4. Расчет химических сдвигов 88
3.3.5.Пулл-даун анализ взаимодействия ВСД-KvAP и VSTX1 90
Заключение 92
Выводы 94
Благодарности 95
Список использованных источников 97
