Введение
Глава 1 Современное состояние проблемы создания сосудистых протезов малого диаметра на основе биодеградируемых полимеров (обзор литературы) 17
1.1 Актуальность, мировая потребность, условия рынка и обоснование возможности использования тканеинженерных подходов при создании прочных и биосовместимых сосудистых протезов малого диаметра 17
1.2 Биодеградируемые полимеры и метод электроспиннинга в создании биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра 21
1.3 Феномен клеточной инфильтрации биодеградируемых сосудистых графтов, изготовленных методом электроспиннинга 28
1.4 Увеличение размеров пор и пористости физическими и химическими методами 30
1.5 Пептидные последовательности, имитирующие внеклеточный матрикс, как субстрат для биофункционализации сердечно-сосудистых имплантатов. Методы иммобилизации 33
1.6 Подходы к модификации искусственных каркасов ростовыми факторами и хемоаттрактантными молекулами, пригодными для использования в тканевой инженерии кровеносных сосудов 42
Глава 2 Материалы и методы исследования 55
2.1 Изготовление биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра 55
2.1.1 Изготовление пленочных матриксов с различным долевым соотношением полимеров в растворе 55
2.1.2 Изготовление сосудистых графтов, немодифицированных и модифицированных дифференцировочными молекулами 56
2.2 Протокол модификации RGD- пептидами сосудистых графтов и последующая детекция пептидов на полимерных поверхностях 58
2.2.1 Активация полимерной поверхности сосудистых графтов 58
2.2.2 Коньюгация полимерной поверхности с RGD-пептидами 59
2.2.3 Детекция аминокислот на поверхности сосудистых графтов 59
2.3 Физико-механические испытания сосудистых графтов 60
2.4 Сканирующая электронная микроскопия поверхности сосудистых графтов 61
2.4.1 Сканирующая электронная микроскопия сосудистых графтов до и после модификации поверхности 61
2.4.2 Сканирующая электронная микроскопия эксплантированных образцов графтов 62
2.4.3 Изучение элементного состава кальцификатов в эксплантированных сосудистых графтах 63
2.5 Сравнительная оценка гемосовместимости сосудистых графтов 64
2.6 Оценка биодеградации in vitro трубчатых каркасов и определение кардиотоксичности продуктов деградации 65
2.7 Оценка распределения дифференцировочных молекул в процессе их инкорпорирования в состав сосудистых графтов 67
2.8 Определение in vitro активности RGD- пептидов, ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул в составе сосудистых графтов 68
2.8.1 Изучение адгезии и жизнеспособности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивируемых на поверхности пленочных матриксов c различным соотношением PHBV и PCL 68
2.8.2 Изучение адгезии и жизнеспособности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, культивируемых на поверхности нетканых матриксов с и без RGD 69
2.8.3 Изучение адгезии, жизнеспособности, пролиферации, ангиогенных свойств и секреторной активности клеток гибридомы линии Ea. hy 926, культивируемых на поверхности или в присутствии нетканых матриксов с и без дифференцировочных факторов 70
2.9 Подкожная имплантация пленочных матриксов 74
2.10 Имплантация сосудистых графтов в брюшную часть аорты крыс и оценка проходимости 75
2.11 Гистологическое исследование эксплантированных сосудистых графтов 76
2.12 Иммуногистохимическое исследование эксплантированных сосудистых графтов 78
2.13 Иммунофлуоресцентное исследование эксплантированных сосудистых графтов 79
2.14 Статистические методы 81
Глава 3 Определение оптимальной композиции полимеров для создания каркаса биодеградируемого сосудистого графта 82
3.1 Особенности взаимодействия с клетками in vitro и сроки биодеградации in vivo пленочных матриксов различного полимерного состава 82
3.2 Оценка гемосовместимости нетканых матриксов различного полимерного состава 89
3.3 Оценка биодеградации in vitro трубчатых каркасов на основе PHBV/PCL и определение кардиотоксичности продуктов деградации 93
Глава 4 Разработка протоколов изготовления и модификации биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра с оценкой структуры поверхности и физико-механических свойств 99
4.1 Разработка протоколов изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов методом электроспиннинга c технологий загрузки дифференцировочных факторов в состав нетканых матриксов в процессе электроспиннинга 99
4.2 Разработка протокола изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов с послойным инкорпорированием дифференцировочных факторов. Оценка свойств биодеградируемых трубчатых каркасов с изолированным и послойным инкорпорированием ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул 111
4.3 Разработка протоколов изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов методом электроспиннинга c технологий последующей модификации поверхности RGD- пептидами 117
4.4 Сравнительное изучение физико-механических характеристик биодеградируемых сосудистых графтов, модифицированных RGD пептидами 123
Глава 5 Оценка in vitro биосовместимости полимерных нетканых матриксов на основе полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона, модифицированных RGD пептидами, ростовыми факторами и хемоаттрактантными молекулами 126
5.1 Оценка in vitro активности ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул, инкорпорированных в состав матриксов в процессе двухфазного электроспиннинга 126
5.2 Оценка качества модификации и биосовместимости нетканых матриксов, модифицированных RGD- пептидами 146
Глава 6 Особенности ремоделирования сосудистой ткани in situ на основе функционально активных биодеградируемых графтов малого диаметра в зависимости от приемов модификации поверхности 151
6.1 Изменение физико-механических характеристик биодеградируемых сосудистых графтов в процессе долгосрочной имплантации на фоне ремоделирования сосудистой ткани на месте биодеградируемого трубчатого каркаса 151
6.2 Сравнительные результаты долгосрочной имплантации биодеградируемых сосудистых графтов, модифицированных VEGF (модель придания функциональной активности трубчатому каркасу в процессе его изготовления) или RGD- пептидами (модель химической модификации поверхности готового каркаса) 157
6.3 Результаты имплантации биодеградируемых сосудистых графтов диаметром 2 мм с изолированно и послойно инкорпорированными VEGF, bFGF и SDF-1 и особенности ремоделирования элементов новообразованной сосудистой ткани на их основе 167
6.4 Формирование элементов новообразованной сосудистой ткани в зоне локации сосудистых графтов PHBV/PCL/GF mix диаметром 1,5 мм 178
Глава 7 Изучение процессов кальцификации эксплантированных сосудистых графтов 194
Заключение 210
Выводы 218
Практические рекомендации 220
Список сокращений 221
Список литературы 224
