Введение
Глава 1. Принципы конструирования иммуноанализа 17
Глава 2. Характеристика возбудителя хламидиоза собственные исследования
Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований 60
3.1. Биомодели для получения препаративного количества специфических хламидииных антител 60
3.2. Клинический материал от овец 60
3.3. Антигены 61
3.4. Методы получения специфических хламидииных антител (иммуноглобулинов) 61
3.4.1. Иммунизация биомоделей 61
3.4.2. Получение и выделение специфических иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей и сыворотки крови кроликов 62
3.4.3. Определение чистоты выделенных иммуноглобулинов. 64
3.5. Методы изучения диагностической значимости
полученных хламидииных антител и сконструированных на их
основе экспериментальных вариантов иммуноанализа для
выявления возбудителя хламидиоза овец 65
3.5.1. Определение титра полученных мышиных и кроличьих хламидииных антител 65
3.5.2. Определение диагностической значимости экспериментальных хламидииных антител 66
3.5.3. Бактериоскопические исследования клинического материала от овец 66
3.6. Методы приготовления конъюгата антихламидийных
иммуноглобулинов с коллоидным золотом 67
3.6.1. Получение раствора коллоидного золота 67
3.6.2. Определение «золотого числа» 67
3.6.3. Конъюгирование антихламидийных иммуноглобулинов с наночастицами коллоидного золота
3.6.4. Концентрирование иммунозолотого конъюгата 68
3.7. Молекулярно-генетические методы 69
3.7.1. Выделение ДНК из клинического материала от овец 69
3.7.2. Проведение ПЦР-амплификации 69
3.7.3. Детекция продуктов ПЦР-амплификации 76
3.8. Оборудование, материалы и реактивы 77
3.8.1. Оборудование 77
3.8.2. Основные материалы 78
3.8.3. Реактивы и растворы 79
3.9. Статистические методы и компьютерная обработка результатов 81
ГЛАВА 4. Разработка экспериментальной биотехнологии получения специфических хламидииных антител как основы иммунотестов для выявления возбудителя хламидиоза овец 82
4.1. Оптимизация получения специфических антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») с использованием в качестве биопродуцентов кроликов и инбредных мышей 84
4.1.1. Получение специфических кроличьих антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») 85
4.1.2. Получение специфических мышиных антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») 90
4.2. Оптимизация получения мышиных специфических антител к комбинации антигенов к С. trachomatis и С. psittaci («С-аг-2»). 94
4.3. Получение препаративного количества специфических хламидийных антител, выделение и оптимизация способов хранения иммуноглобулиновой фракции 96
4.4. Изучение диагностической значимости отдельных экспериментальных серий моноспецифических хламидийных антител с использованием расширенной панели клинических образцов от овец 102
ГЛАВА 5. Конструирование и апробация экспериментальных вариантов иммуноанализа для экспресс-диагностики хламидиоза овец 107
5.1. Приготовление конъюгата моноспецифических антихламидийных иммуноглобулинов и коллоидного золота с диаметром наночастиц 20 и 40 нм 108
5.2. Конструирование вариантов ДИА на основе экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов «Ig4 4 Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40» 110
5.2.1. Изучение влияния способов инкубирования НЦМ с нанесенными клиническими образцами в иммунозолотом конъюгате на результаты иммунотеста
5.2.2. Изучение влияния твердой фазы на результаты иммуноанализа 113
5.2.3. Изучение влияния способов фиксации клинического материала на твердой фазе при постановке ДИА с использованием экспериментальных серий иммунозолотого конъюгата на количество ложноотрицательных и ложноположительных ответов 115
5.2.4. Оптимизация интенсивности цветного сигнала в ДИА
путем концентрирования иммунозолотых конъюгатов 116
5.2.5. Изучение влияния способов блокировки свободных сайтов НЦМ на результаты ДИА 118
5.2.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального ДИА40/15 на клинических образцах от овец 121
5.3. Конструирование экспериментального варианта иммунохроматографического анализа с использованием «Ig4 Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40» 121
5.3.1. Подбор аналитических мембран для оптимизации активности иммунозолотого конъюгата и изучения эффективности формирования цветного сигнала 122
5.3.2. Сравнительное изучение методов фиксации иммуноглобулинов на аналитической мембране 124
5.3.3. Изучение влияния блокировки свободных сайтов аналитической мембраны на визуализацию результатов иммунохроматографического анализа 127
5.3.4. Выбор мембран для фиксации иммунозолотого конъюгата 128
5.3.5. Изучение влияния тест-буферов на эффективность индикации возбудителя хламидиоза овец иммунохроматографической тест-системой 130
5.3.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального варианта иммунохроматографической тест-системы на клинических образцах от овец 133
ГЛАВА 6. Разработка системы валидации иммунотестов для экспресс-диагностики хламидиоза овец с использованием современных молекулярно-генетических методов 135
6.1. Выявление ДНК С. trachomatis в клиническом материале от овец с применением коммерческих ПЦР тест-систем 135
6.2. Определение геновара ДНК С. trachomatis, присутствующей в клинических образцах от овец 137
6.3. Изучение изменений в геноме С. trachomatis из клинического материала от овец с использованием праимеров на плазмидные и хромосомные мишени 140
6.3.1 Изучение изменений в криптической плазмиде
С. trachomatis при помощи праимеров на гены ог/2 и ог/8 141
6.3.2. Детекция ДНК С. trachomatis с использованием в качестве мишени хромосомного гена ібЗрибосомального
белка С. trachomatis (16SRB) 142
6.3.3 Определение нуклеотидной последовательности и изучение полиморфизма гена ompl С. trachomatis в
клинических образцах от овец 143
6.3.4. Выявление в клиническом материале от овец новых «шведских» вариантов С. trachomatis с делецией в плазмиде 150
Заключение 153
Выводы 164
Список сокращений и условных обозначений 165
Список литературы
