Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Ионы кальция - как универсальный регулятор внутриклеточных процессов 10
1.2. Са как вторичный мессенжер в передачи информации 12
1.3. Участие митохондрий в контролировании внутриклеточной концентрации ионов кальция 15
1.4. Системы транспорта кальция в митохондриях 15
1.4.1. Электрогенная система входа кальция в митохондрии 16
1.4.2. Системы выхода кальция из митохондрий 17
1.4.2.1. Электронейтралъный обмен кальция на натрий 18
1.4.2.2. Электронейтралъный обмен кальция на протон 19
1.5. Митохондриальная циклоспорин А-чувствительная пора 20
1.6. Митохондриальная циклоспорин А-нечувствительная пора 24
1.7. Физиологическая значимость свободных жирных кислот 27
1.8. Роль жирных кислот в функционировании митохондрий 28
1.9. Апоптоз и некроз — два варианта гибели клеток 29
1.9.1. Морфологические критерии 30
1.9.2. Молекулярно-биохимические критерии 31
1.10. Участие митохондрий в развитии апоптоза 32
1.11. Пальмитиновая кислота как природный активатор апоптоза 35
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 38
2.1. Метод выделения митохондрий из печени крыс 38
2.2. Метод выделения митопластов из митохондрий печени крыс 39
2.3. Метод получения внутренней мембраны митохондрий и межмембранных контактных участков 39
2.4. Определение концентрации митохондриального белка 40
2.5. Экстракция липидов из мембраны митопластов с помощью этанола 40
2.6. Разделение гидрофобных и гидрофильных компонентов митопластов 41
2.6.1. Модификация метода Фолча 41
2.6.2. Выделение Са2+-связывающего компонента и жирных кислот модифицированным методом Фолча из малых количеств митопластов 41
2.6.3. Выделение жирных кислот по методу Блайя и Дайэра 42
2.6.4. Выделение жирных кислот по методу Боумену и Берозы 42
2.7. Очистка гидрофобного экстракта на колонке с кремниевой
кислотой 43
2.8. Аналитическая и препаративная тонкослойная хроматография 43
2.9. Определение Са2+-связывающих свойств 44
2.10. Разделение митохондриальных липидов на классы на колонке с аминопропилсиликагелем (Sep-PAK, Waters) 45
2.11. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента 46
2.12. Определение химической природы вещества 47
2.12.1. Ультрафиолетовая спектроскопия 47
2.12.2. Инфракрасная спектроскопия 47
2.12.3.ЯМР-спектрометрия 48
2.12.4. Газожидкостная хроматография жирных кислот 48
2.13. Определение содержания пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях 49
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение экспериментов 50
3.1. Очистка митохондриального низкомолекулярного гидрофобного Са2+-
связывающего компонента 50
3.2. Са +-связывающие параметры изучаемого компонента 55
3.3. Влияние различных ионов на способность связывать Са2+изучаемым веществом 58
3.4. Локализация гидрофобного Са2+-связывающего компонента в митохондриях 59
3.5. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента 61
3.6. Определение химической природы Са -связывающего компонента 63
3.6.1. Ультрафиолетовая спектроскопия Са -связывающего компонента...63
3.6.2. Инфракрасная спектроскопия Са2+-связывающего компонента 64
1 9-І-
3.6.3. Спектры Н-ЯМР Са -связывающего гидрофобного компонента 67
3.6.4. Газожидкостная хроматография Са2+-связывающего компонента 68
3.7. Инфракрасная спектроскопия пальмитиновой кислоты, пальмитиновой кислоты в комплексе с кальцием и пальмитата натрия 69
3.8. Сравнение методов выделения свободных жирных кислот 71
3.9. Определение Са -связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот 71
3.10. Влияние различных катионов на Са -связывающие свойства пальмитиновой кислоты 73
3.11. Определение ион-транспортирующих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот 76
3.12. Сравнение Са -связывающих свойств различных липидов 76
3.13. Влияние Са2+ и ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях печени крысы 82
Заключение 84
Выводы 90
Список литературы
