Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура триазиновых пестицидов 9
1.2. Циркуляция триазиновых пестицидов в экосистемах 14
1.3. Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм 16
1.4. Действие триазиновых пестицидов на живые организмы 19
1.4.1. Высшие растения и водоросли 19
1.4.2. Беспозвоночные 19
1.4.3. Позвоночные 20
1.4.4. Бактерии и грибы 24
1.5. Биодеградация триазиновых соединений 25
1.5.1. Высшие растения и водоросли 25
1.5.2. Млекопитающие 27
1.5.3. Бактерии 29
1.5.4. Грибы 32
1.5.4.1 Лигнинпероксидазы 34
1.5.4.2 Марганецпероксидазы 35
1.5.4.3 Лакказы 36
1.6. Неферментативная деструкция триазиновых соединений 49
1.7. Заключение 51
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы, используемые в работе 52
2.1.1. Реактивы 52
2.1.2. Комплексы рутения 53
2.1.3. Штаммы 53
2.2. Поверхностное культивирование 53
2.3. Глубинное культивирование 54
2.4. Индукция биосинтеза лакказы при глубинном культивировании 55
2.4.1. Индукция биосинтеза лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus при получении индуцибельных форм фермента 55
2.4.2. Индукция биосинтеза лакказы при деструкции атразина 55
2.5. Выделение и очистка конститутивных и индуцибельных форм лакказы 55
2.6. Определение молекулярных масс ферментов 56
2.7. Определение активности оксидоредуктаз 57
2.7.1. Активность лакказы 57
2.7.2. Активность Мп-пероксидазы 57
2.8. Спектральные измерения 58
2.9. Определение количества ионов меди 58
2.10. Определение оптимумов рН каталитической активности лакказы 58
2.11. Определение термостабильности (или термической инактивации) лакказы 59
2.12. Определение оптимумов температуры каталитической активности лакказы. 59
2.13. Определение кинетических параметров субстратов лакказы 59
2.14. Анализ углеводной части лакказы 60
2.15. Анализ аминокислотного состава лакказы 60
2.16. Определение концентрации белка 61
2.17. Определение концентрации атразина методом иммуноферментного анализа 61
2.18. Определение сорбции атразина на мицелии базидиальных грибов 62
2.19. Методы анализа систем «медиатор/лакказа Coriolopsis fulvocinerea» 62
2.19.1. Электрохимическая характеристика медиаторов 62
2.19.2. Спектрофотометрия медиаторов, систем «атразин/медиатор» и «атразин/медиатор/лакказа» 62
2.20. Модельные системы «атразин/медиатор/лакказа Coriolopsis fulvocinerea» и анализ
образующихся продуктов трансформации 63
2.20.1. Состав модельных систем 63
2.20.2. Анализ модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 64
2.20.3. Анализ методом протонного ядерного магнитного резонанса 64
2.20.4. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии -тандемной масс-спектрометрии 65
Глава 3. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм лакказы
Coriolus hirsutus 66
3.1.1. Глубинное культивирование Coriolus hirsutus, выделение и очистка форм фермента 67
3.1.2. Биохимические свойства форм лакказы Coriolus hirsutus 70
3.1.3. Физико-химические свойства форм лакказы Coriolus hirsutus 74
3.1.4. Субстратная специфичность лакказ 77
3.2. Влияние индукторов на деградацию атразина и биосинтез оксидоредуктаз при
глубинном культивировании базидиомицетов 79
3.2.1. Изменение Мп-пероксидазной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина 80
3.2.2. Динамика лакказной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина 83
3.2.3. Выбор индуктора и времени его внесения 86
3.2.4. Изучение сорбции атразина на мицелии 91
3.3. Характеристика внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea 91
3.4. Сравнительная характеристика субстратов, используемых в качестве медиаторов в реакции с лакказой базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea 97
3.4.1. Электрохимическая характеристика медиаторов 98
3.4.2. Изучение кинетических параметров исследуемых субстратов 103
3.5. Исследование трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу
Coriolopsis fulvocinerea и редокс-медиатор 105
3.5.1. Характеристика модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 105
3.5.2. Характеристика продуктов трансформации атразина в модельных системах методом протонного ядерного магнитного резонанса 113
3.5.3. Исследование продуктов трансформации атразина в модельных системах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс- спектрометрии 117
3.6. Механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс-медиатора (ГБТ) 122
Выводы 124
Список литературы 125
