Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Гомологичная рекомбинация 11
1.1.1. Основные стадии и пути гомологичной рекомбинации 11
1.1.2. Основные белки, вовлеченные в соматическую гомологичную рекомбинацию у человека 1 4
1.1.3. Гомологичная рекомбинация в процессе канцерогенеза 17
1.1.4. Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний 19
1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному 23
1.2. (CA/TG)n-микросателлитные последовательности 25
1.2.1. Локализация и особенности строения poly(CA/TG)-локусов .2 5
1.2.2. Функциональные возможности (СА/TG)n-повторов 26
1.2.2.1. Роль микросателлитных повторов в организации хроматина 26
1.2.2.2. Роль (СА/TG)n-повторов в регуляции экспрессии генов 27
1.2.2.3. Участие (СА/TG)n-повторов в гомологичной рекомбинации 29
1.2.3. Структурные особенности poly(CA/TG) 31
1.2.3.1. poly(CA/TG) и Z-форма ДНК 31
1.2.3.2. poly(CA/TG) и квадруплексная структура 35
1.2.4. Мутационная изменчивость poly(СА/TG) и системы контроля стабильности у различных организмов 3 5
1.2.4.1. Механизмы изменения числа повторяющихся единиц в CA микросателлитах 37
1.2.4.2. Факторы, влияющие на стабильность (CA/TG)n-повторов 39
1.3. CA-микросателлиты как сайты инициации и терминации
гомологичной рекомбинации 42 1.3.1. CA-микросателлиты как сайты терминации гомологичной рекомбинации: модельные системы и предварительные данные 42 1.3.2. CA-микросателлиты как сайты инициации гомологичной
рекомбинации 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Список использованных реактивов и олигонуклеотидов 47
2.2. Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19 50
2.2.1. Фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов 50
2.2.2. Процедура формирования дуплексов 51
2.2.3. Реакция лигирования ДНК 51
2.2.4. Трансформация бактериальных клеток E.Coli штамма XL10-Gold 51
2.2.4.1. Приготовление компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold 51
2.2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold с использованием «бело-голубой» селекции 52
2.3. Выделение плазмидной ДНК 53
2.4. Выделение геномной ДНК из ткани 54
2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции 55
2.6. Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции 55
2.7. Осаждение ДНК в этаноле 56
2.8. Кинирование 5 -концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором... 56
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 57
2.10. Визуализация ДНК 57
2.10.1. Окрашивание ДНК с помощью SYBR Gold 57
2.10.2. Окрашивание ДНК с помощью бромистого этидия 58
2.10.3. Авторадиография 58
2.10.4. Визуализация ДНК, несущей флуоресцентные зонды FAM и TAMRA 58
2.11. Извлечение ДНК из агарозного геля 59
2.11.1. Экстракция с помощью ДНК-связывающего матрикса на основе двуокиси кремния 59 2.11.2. Выделение ДНК с помощью электроэлюции 60
2.12. Определение концентрации ДНК и SYBR Gold 60
2.13. Электронная микроскопия 60
2.14. Статистическая обработка результатов электронной микроскопии 61
Глава 3. Результаты исследования 62
3.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания 62
3.1.1. Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза 63
3.1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК 65
3.1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от соотношения SG/ДНК 67
3.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)n повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации 70
3.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея 70
3.2.1.1. Модельная система 70
3.2.1.2. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами 73
3.2.1.3. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК 74
3.2.1.4. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное число (CA/TG)n-повторов 75 3.2.2.Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК 76
3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов 77
3.2.2.2. Инвазия олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в эукариотическую ДНК 79
3.2.2.3. Олигонуклеотидная инвазия в ди-, три- и терануклеотидные последовательности 80
3.2.2.4. Анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в (CA/TG)n-последовательность дуплексной ДНК после удаления ранее сформированного комплекса 83
3.2.2.5. Встраивание олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в дуплексную ДНК с разной длиной (CA/TG)n-повтора 86
3.2.2.6. Зависимость интенсивности инвазии олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в плазмиду, содержащую (CA/TG)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид 87
3.2.2.7. Олигонуклеотидная инвазия в разных солевых условиях 89
Глава 4. Обсуждения 92
4.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания 92
4.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)n-повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации 96
4.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея 97
4.2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК 100
Заключение 105
Выводы 108
Список сокращений 110
Список литературы .
