Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Потенциал иммунной системы в борьбе с опухолью 13
1.2. Роль цитотоксических Т-лимфоцитов в противоопухолевом иммунном ответе 15
1.3. Дифференцировка и созревание цитотоксических Т-лимфоцитов 20
1.3.1. Наивные Т-лимфоциты 20
1.3.2. Субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови 22
1.3.3. Дополнительные субпопуляции Т-клеток памяти 23
1.4. Методы исследования популяций Т-клеток памяти 26
1.4.1. Идентификация антиген-специфичных Т-клеток с помощью МНС-мультимеров 27
1.5. Дендритные клетки 31
1.5.1. Иммунобиология дендритных клеток 31
1.5.2. Получение дендритных клеток in vitro 34
1.5.3. Методы ex vivo нагрузки дендритных клеток опухолевыми антигенами 36
1.6. Опухоль-ассоциированные антигены 38
1.6.1. Классификация опухоль-ассоциированных антигенов 39
1.6.2. Опухоль-ассоциированный антиген HER2/neu 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Среды и реагенты 49
2.2. ДНК-конструкции 51
2.3. Объект исследования 51
2.4. Генотипирование для выявления аллеля HLA-A 02 54
2.5. Выделение мононуклеарных клеток из цельной периферической крови. 56
2.6. Получение прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток. Получение незрелых дендритных клеток из моноцитов прилипающей фракции МНК 56
2.6.1. Оптимизация метода выделения прилипающей фракции МНК 57
2.7. Трансфекция незрелых дендритных клеток. Стимуляция созревания трансфицированных дендритных клеток. 59
2.8. Фенотипирование дендритных клеток и оценка их функциональной активности 60
2.9. Получение активированных HER2-специфичных Т-лимфоцитов 60
2.10. Окрашивание стрептамерами и идентификация HER2-специфичных Т-лимфоцитов 61
2.11. Фенотипирование цитотоксических Т-лимфоцитов 62
2.12. Изоляция HER2-специфичных Т-лимфоцитов 63
2.13. Стимуляция пролиферации HER2-специфичных Т-лимфоцитов и оценка эффективности магнитной сортировки 63
2.14. Оценка экспрессии гена ErbB2 в клетках опухолевой линии MCF-7 64
2.15. Анализ цитотоксичности HER2-специфичных клеток 66
2.16. Определение концентрации IFN- в кондиционных средах 69
2.17. Методы статистической обработки 70
Глава 3. Результаты собственных исследований 71
3.1. Оценка содержания HER2-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови условно-здоровых доноров и пациентов с HER2-позитивным раком молочной железы 71
3.2. Разработка протокола получения HER2-специфичных Т-лимфоцитов 72
3.2.1. Оптимизация метода выделения прилипающей фракции мононуклеарных клеток 72
3.2.2. Оценка эффективности доставки ДНК-конструкции в дендритные клетки методами магнитной трансфекции и нуклеофекции 74
3.2.3. Оценка фенотипа и функциональной активности полученных дендритных клеток 75
3.2.4. Оценка содержания HER2-специфичных Т-лимфоцитов в совместной культуре мононуклеарных клеток и нагруженных антигеном дендритных клеток 79
3.2.5. Получение популяций цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам Е75 и Е88 антигена HER2/neu 81
3.2.6. Обогащение культуры отсортированных HER2-специфичных Т-лимфоцитов 83
3.2.7. Подбор клеток-мишеней для анализа специфического противоопухолевого клеточного иммунного ответа 84
3.3. Цитотоксические свойства HER2-специфичных Т-лимфоцитов 87
3.3.1. Анализ цитотоксичности HER2-специфичных Т-лимфоцитов против клеток линии MCF-7 87
3.3.2. Анализ продукции IFN- 90
3.4. Фенотипирование цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам HER2/neu 91
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 99
Заключение 112
Выводы 114
Список сокращений 116
Список литературы 117
