СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................5
ВВЕДЕНИЕ .........................................................................................................................................6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................12
1.1. Противовирусный иммунный ответ ....................................................................................12
1.2. Противовирусная роль TLR4................................................................................................13
1.3. Роль CD55/DAF в иммунном ответе на вирусную инфекцию..........................................16
1.4. Роль хемокинового рецептора CXCR6 в развитии иммунного ответа на вирусную
инфекцию ......................................................................................................................................18
1.5. Роль TIM-3 (HAVCR2) в регуляции противовирусного ответа .........................................20
1.6. Однонуклеотидные полиморфизмы некодирующих регуляторных областей генома
человека и механизмы их влияния на регуляцию экспрессии генов.......................................23
1.7. Методы функциональной характеристики SNP .................................................................24
1.8. Однонуклеотидные полиморфизмы, ассоциированные с тяжелым или хроническим
течением вирусных заболеваний ................................................................................................32
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................34
2.1. Биоинформатические методы...............................................................................................34
2.1.1. Поиск потенциальных регуляторных элементов при помощи биоинформатических
баз данных .................................................................................................................................34
2.1.2. Поиск сайтов связывания факторов транскрипции.....................................................34
2.2. Методы работы с эукариотическими клетками..................................................................34
2.2.1. Культивирование клеточных линий U937, Jurkat, CEM и первичной культуры CD4+
Т-лимфоцитов............................................................................................................................34
2.2.2. Выделение первичной культуры CD4+ Т-лимфоцитов ...............................................35
2.2.3. Активация клеточных линий с помощью PMA, иономицина и ЛПС........................35
2.2.4. Трансфекция клеток методом капиллярной электропорации ....................................35
2.3. Молекулярно-биохимические и иммунологические методы............................................35
2.3.1. Создание генетических конструкций на базе вектора pGL3-basic ............................35
3
2.3.2. Получение компетентных клеток..................................................................................43
2.3.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока..............................43
2.3.4. Выделение и очистка плазмид.......................................................................................43
2.3.5. Измерение активности регуляторных элементов в составе генетических
конструкций с помощью двойного люциферазного теста....................................................44
2.3.6. Выделение тотальной РНК и синтез первой цепи комплементарной ДНК..............44
2.3.7. Измерение относительной экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени ...45
2.3.8. Подавление экспрессии генов SPI1 (PU.1) и c-Myb с использованием siРНК .........47
2.3.9. Оценка связывания ТФ c-Myb с областью вокруг rs71327024 методом ДНК “pulldown”..........................................................................................................................................48
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................50
3.1. Анализ полиморфизма rs2564978 в промоторе CD55........................................................50
3.1.1. Определение границ промоторной области, содержащей полиморфизм rs256497850
3.1.2 Активность промотора гена CD55 снижается в присутствии минорного
rs2564978(Т) аллеля в клеточной модели человеческих макрофагов по сравнению с
промотором, содержащим С-аллель. ......................................................................................51
3.1.3. Транскрипционный фактор PU.1 (SPI1) участвует в аллель-специфическом
влиянии полиморфизма rs2564978 на активность промотора CD55 в клеточной модели
макрофагов ................................................................................................................................52
3.2. Анализ регуляторных элементов гена TLR4 .......................................................................56
3.2.1. Биоинформатический анализ регуляторных элементов гена TLR4 ...........................56
3.2.2. Энхансер гена TLR4 усиливает активность его промотора в моноцитах U937,
однако аллельные варианты полиморфизма rs11536889 не оказывают значимого влияния
на его активность ......................................................................................................................57
3.2.3. Энхансер гена TLR4, содержащий рисковый С-аллель rs7873784, обладает более
высокой активностью в моноцитах U937, чем вариант, содержащий мaжорный G-аллель
.....................................................................................................................................................58
3.2.4. Фактор транскрипции PU.1 (SPI1) играет роль в аллель-специфическом влиянии
полиморфизма rs7873784 на активность промотора TLR4 в моноцитах.............................58
3.3. Анализ регуляторных элементов CXCR6 в модели активированных T-хелперов ..........62
3.3.1. Биоинформатический анализ регуляторных элементов гена CXCR6.
Экспериментальная характеристика потенциальных промоторных областей CXCR6 в Тклеточной линии Jurkat ............................................................................................................62
4
3.3.2. Экспериментальная характеристика полиморфизма rs71327024 в потенциальной
энхансерной области гена CXCR6...........................................................................................64
3.3.3. rs71327024(G) формирует сайт связывания фактора транскрипции c-Myb в клетках
Jurkat, активированных PMA...................................................................................................65
3.4. Анализ регуляторных элементов гена HAVCR2, кодирующего рецептор TIM-3, в
модели активированных T-хелперов ..........................................................................................69
3.4.1. Выбор регуляторной области вокруг полиморфизма rs12186731..............................69
3.4.2. Альтернативные варианты полиморфизмов rs12186731, rs10515746 и rs4704853 не
влияют на активность промотора гена HAVCR2 в активированных Jurkat.........................70
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................72
ВЫВОДЫ...........................................................................................................................................74
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................................75
БЛАГОДАРНОСТИ ..........................................................................................................................88
