ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 12
1.1. Рыбы Danio rerio как организменная модель для изучения
функционирования векторных компонентов........................................................ 12
1.2. Генетические регуляторные элементы, функционирующие в тканях
микроокружения опухоли...................................................................................... 16
1.2.1. Компоненты микроокружения опухоли как мишень и продуценты
терапевтических агентов.................................................................................... 16
Популяционный состав опухолевого микроокружения и занимаемый объем 16
Функциональная значимость опухоль-ассоциированных фибробластов ....... 17
Маркерные гены опухоль-ассоциированных фибробластов ............................ 20
1.2.2. Ген фактора роста соединительной ткани и ген фибробластактивирующего белка как потенциальные источники регуляторных
элементов ............................................................................................................ 21
1.2.2.1. Функционирование нативных генов и продуктов их экспрессии...... 21
Функциональная значимость FAP и CTGF на организменном уровне............ 21
Активность генов FAP и CTGF в опухолевой среде......................................... 24
Продуценты FAP и CTGF в опухолевой среде.................................................. 26
1.2.2.2. Функционирование промоторных последовательностей генов FAP и
CTGF человека в составе генетических конструкций...................................... 28
Характеристика промоторных последовательностей генов FAP и CTGF
человека............................................................................................................... 28
Эффективность функционирования промоторов генов FAP и CTGF человека
в составе векторных систем ............................................................................ 29
1.3. Цитотоксический ген 3С протеазы вируса гепатита А человека как
потенциальный векторный компонент ................................................................. 30
1.3.1. Функциональная значимость протеазы 3С вируса гепатита А человека
как патогенного фактора пикорнавирусной инфекции.................................... 34
3
1.3.2. Функционирование гена 3С протеазы hHAV в составе генетических
конструкций........................................................................................................ 38
Цитотоксическое действие 3С протеазы hHAV............................................. 38
Эффективность цитотоксического действия 3С протеазы hHAV .............. 39
1.4. Заключение..................................................................................................... 41
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................. 46
2.1. Использованный материал ............................................................................ 46
2.1.1. Реактивы................................................................................................... 46
2.1.2. Генетические конструкции...................................................................... 46
2.1.3. Культуры клеток ...................................................................................... 48
2.1.4. Модельный организм............................................................................... 48
2.2. Использованные методы ............................................................................... 49
2.2.1. Манипуляции с генетическими конструкциями .................................... 49
2.2.2. Трансфекция эукариотических клеток ................................................... 49
2.2.3. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки Danio rerio...... 49
2.2.4. Биоимиджинговый анализ....................................................................... 50
2.2.5. Анализ уровня люциферазной активности............................................. 51
2.2.6. Эмбриотоксический анализ..................................................................... 52
2.3. Биоинформатический анализ ........................................................................ 52
2.4. Статистический анализ.................................................................................. 53
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................ 54
3.1. Формирование системы количественной и качественной оценки
функционирования векторных конструкций в развивающемся организме Danio
rerio ......................................................................................................................... 54
3.1.1. Базовые характеристики функционирования векторов и методы их
анализа ................................................................................................................ 54
3.1.2. Генетические конструкции и характеристика их функционирования на
культурах перевиваемых клеток ....................................................................... 56
3.1.3. Характеристика функционирования генетических конструкций в
развивающихся эмбрионах Danio rerio............................................................. 56
4
3.1.3.1.Накопление маркерного белка в развивающихся организмах Danio
rerio при использовании люциферазной системы оценки ............................... 57
3.1.3.2.Распределение клеток, экспрессирующих маркерный белок, у
развивающихся организмов Danio rerio при использовании флуоресцентной
системы оценки .................................................................................................. 58
Оценка количества клеток зебрафиш, экспрессирующих маркерный белок, в
зависимости от дозы введенного вектора и времени анализа ....................... 58
Определение типов клеток зебрафиш, в которых экспрессируется
маркерный белок................................................................................................. 62
3.1.3.3.Анализ выживаемости и формирования патологий в развитии
организмов Danio rerio при использовании системы оценки
эмбриотоксичности ............................................................................................ 66
Выживаемость и формирование нарушений в развитии в группе интактных
животных........................................................................................................... 66
Анализ эмбриотоксических эффектов в группе инъецированных животных 69
3.2. Характеристика функционирования промоторов строма-ассоциированных
генов человека на организменном уровне ............................................................ 74
3.2.1. Генетические конструкции и характеристика их функционирования на
уровне культур клеток ....................................................................................... 75
3.2.2. Анализ накопления маркерного белка люциферазы, обусловленного
функционированием промоторов FAP и CTGF................................................ 76
3.2.3. Оценка распределения экспрессии маркерного белка EGFP в организме
Danio rerio, обусловленной функционированием промоторов генов FAP и
CTGF................................................................................................................... 78
Оценка накопления клеток зебрафиш, в которых происходит экспрессия
маркерного белка EGFP..................................................................................... 82
3.2.4. Накопление репортерного белка у аномальных особей Danio rerio при
использовании промоторов генов FAP и CTGF человека в генетических
конструкциях...................................................................................................... 87
5
3.2.5. Анализ эмбриотоксических эффектов при введении конструкций с
промоторами генов FAP и CTGF человека в Danio rerio................................. 90
3.3. Характеристика токсических эффектов при экспрессии протеазы 3С
вируса гепатита А человека на организменном уровне ....................................... 94
3.3.1. Генетические конструкции, содержащие ген протеазы 3С hHAV........ 95
3.3.2. Анализ эмбриотоксического действия 3С протеазы hHAV в
развивающихся организмах Danio rerio ........................................................... 97
3.4. Заключение................................................................................................... 100
ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 105
БЛАГОДАРНОСТИ ................................................................................................. 106
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................... 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................ 109
ПРИЛОЖЕНИЯ........................................................................................................ 141
