Введение
Обзор литературы 14
Классификация мобильных генетических элементов эукариот 14
Автономные ДКП-ретроэлементы 18
Мобильные элементы группы Ty3/Gypsy 21
Мобильные элементы группы BEL/Pao 22
Семейство Retroviridae 23
Неавтономные ДКП-ретроэлементы 25
Не содержащие ДКП ретроэлементы 26
ретроэлементы, кодирующие тирозинрекомбиназу 27
Ретротранспозоны семеЙства Penelope (PLE) 28
Формирование новых мобильных элементов и вирусов 32
Интеграза как ключевой фермент ДКП-ретроэлементов 34
Сходство жизненных циклов ДКП-ретротранспозонов и ретровирусов 34
Структура интегразы 36
Реакции, катализируемые интегразой 41
Реакция 3 -концевого процессинга 41
Реакция переноса цепи 43
Реакция дезинтеграции 44
Взаимодействие интегразы с ДНК 46
Взаимодействие интегразы с ДНК-субстратом 46
Взаимодействие интегразы с ДНК-мишенью 47
Роль клеточных белков в распознавании ДНК-мишени интегразой 48
Влияние вторичной структуры хромосомной ДНК на связывание ДНК-мишени
интегразой 49
Генетический контроль транспозиции Ретроэлементов 51
Цис- и транс-факторы, регулирующие экспрессию ДКП-ретротранспозонов у
Drosophila melanogaster 51
Роль локуса flamenco в контроле транспозиции ДКП-ретроэлементов 53
Роль гетерохроматиновых белков семейства НР1 в регуляции активности ДКП ретроэлементов 58
Другие механизмы противовирусной защиты 60
Взаимоотношения ДКП-ретроэлементов с хозяйским геномом 63
Потенциальные эффекты транспозиций мобильных элементов 63
Молекулярная доместикация генов мобильных элементов 67
Доместикация гена gag ДКП-ретроэлементов 71
Материалы и методы 74
Линии Drosophila melanogaster и условия культивирования 74
Сбор эмбрионов, личинок и тканей взрослых особей 74
Индукция иммунного ответа у Drosophila melanogaster 74
Штаммы Escherichia coli и условия культивирования 75
Молекулярный анализ ДНК 76
Разделение фрагментов ДНК и РНК методом электрофореза 76
Векторы и Конструирование рекомбинантных плазмид 76
Экспрессия конструкций, кодирующих рекомбинантные белки, в клетках
Escherichia coli, и выделение рекомбинантных белков 77
Диализ растворов белков 78
Выделение мембранной фракции белка для вестерн-блот гибридизации 78
Электрофорез белков в полиакриламидном геле 78
Эндонуклеазная реакция 79
Анализ продуктов активности рекомбинантной интегразы 80
Анализ ДНК-связывающей активности интегразы 80
Вестерн-блот-гибридизация 81
Выделение геномной ДНК из мух 81
Выделение тотальной РНК из мух 82
Синтез кДНК 82
Полимеразная цепная реакция 82
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 85
Вычитающая гибридизация 85
Инвертированная ПЦР 88
Быстрая амплификация 5 -конца кДНК (RACE) 88
Секвенирование 88
Саузерн-блот-гибридизация 89
Биоинформатический анализ последовательностей 89
Результаты 92
Исследование активности и функции интегразы дкп ретроэлемента gypsy 92
Исследование «точных» эксцизий ДКП-ретротранспозона gypsy в модельной системе в клетках Escherichia coli 93
Получение рекомбинантной интегразы gypsy и исследование ее активности in vitro 98
Исследование активности доменов рекомбинантной интегразы gypsy 105
Исследование in vitro активности рекомбинантной интегразы в отношении мишеней других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy 110
Исследование генетического контроля транспозиции дкп- ретротранспозонов группы gypsy 113
Транскрипция локуса flamenco в лабораторных линиях SS и MS Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco 114
Сравнительный анализ геномной локализации ретротранспозонов Idefix и ZAM с в линииях Drosophila melanogaster SS и MS, мутантных по локусу flamenco 121
Исследование транскрипции и анализ транспозиционной активности МГЭ Tirant в линиях, мутантных по локусу flamenco 125
Филогения и систематика дкп-ретроэлементов дрозофилы 133
Классификация дкп-ретротранспозонов в геноме Drosophila melanogaster 136
Ген env у ДКП-ретротранспозонов 141
Молекулярная филогения ДКП-ретротранспозонов группы gypsy с двумя открытыми рамками считывания у D. melanogaster 142
Молекулярная эволюция ДКП-ретротранспозонов у членистоногих 146
Классификация ДКП-ретротранспозонов, основанная на комплексном анализе последовательностей интеграз, сайтов интеграции и последовательностей длинных концевых повторов 152
Доместикация последовательностей дкп-ретротранспозонов группы gypsy 168
Ген CG4680 Drosophila melanogaster – гомолог gag эррантивирусов и производных
от них ретротранспозонов группы gypsy 169
Анализ экспрессии гена Grp на уровне транскрипции и трансляции 178
Обсуждение 187
Выводы 203
Список литературы 205
