Введение
Обзор литературы 11
1. Фитат Ош-инозитол гексакисфосфат), его комплексы и распространение в природе 11
2. Фитазы - группа специфических фосфогидролаз
2.1. Продуценты фитаз 14
2.2. Классификация и характеристика фитаз 18
3. Трансгенные растения с интегрированными генами микробных фитаз 27
3.1. Экспрессия генов микробных фитаз в растениях 28
3.2. Эффективные системы экспрессии рекомбинантных фитаз в трансгенных растениях 35
4. Свойства рекомбинантных белков 36
5. Влияние рекомбинантных фитаз на растительный организм 39
Заключение 41
Экспериментальная часть 43
Материалы и методы 43
1. Растения Arabidopsis thaliana 43
2. Штаммы бактерий и плазмиды 44
3. Плазмиды и конструкции экспрессионных систем 45
4. Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens GV3101 и E.coli DH5a 47
5. Трансформация растений Arabidopsis thaliana 47
6. Выделение геномной ДНК растений 48 7. Выделение тотальной РНК растений 49
8. Получение кДНК 49
9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 10. Электрофорез ДНК 51
11. Выделение белковых фракции из тканей растений 54
12. Электрофорез в ПААГ 54
13. Вестерн-блоттинг 55
14. Определение фитазной активности 56
15. Измерение сухого веса тканей растений и определение содержания тканевого фосфора в побегах растений 57
16. Измерение морфологических параметров растений 58
17. Математическая обработка результатов 59
Результаты исследований 60
1. Получение растений Arabidopsis thaliana с интегрироваными генами бактериальных фитаз 60
1.1. Создание гетерологичной системы экспрессии 60
1.2. Селекция трансгенных растений
3. Экспрессия модифицированного гена фитазы на уровне транскрипции 66
4. Иммуноблотинг продуктов экспрессии генов микробных фитаз в клетках корней растений 68
5. Фитазная активность в корнях трансгенных растений A. thaliana 69
6. Влияние микробных фитаз на морфологию трансгенных растений 6.1. Влияние микробных фитаз на морфологию листьев 72
6.2. Влияние экспрессии микробных фитаз на содержание фосфора в листьях растений 76
6.3. Анализ влияния экспрессии микробных фитаз на морфологию корней ОБСУЖДЕНИЕ результатов 83
Заключение 92
Список литературы 94
