Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Люциферин-люциферазная система светляков и ее биоаналитических применение 11
2.1.1. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на детекции ее субстратов (АТP и люциферин) 14
2.1.2. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на ее детекции как маркера
2.2. Методы получения бифункциональных молекул на основе люциферазы и фотопротеинов 18
2.2.1. Методы химической конъюгации. Основные подходы 19
2.2.2. Химически полученные конъюгаты на основе люцифераз и фотопротеинов 21
2.2.3. Методы генетической инженерии по созданию гибридных белков на основе люциферазы 25
2.2.4. Гибридные белки, полученные на основе люцифераз светляков 26
2.3. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков в биоспецифическом анализе 32
2.3.1. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков в гетерогенном ИФА 33
2.3.2. Применение гибридных белков на основе люциферазы светляков для определения ДНК или РНК 36
2.4. Биоаналитические системы на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) с использованием люциферазы. 39
2.4.1. Основные принципы BRET 39
2.4.2. BRET-системы на основе Renilla люциферазы 41
2.4.3. BRET-системы на основе люциферазы светляков 42
2.4.4. Аналитическое применение BRET на основе люциферазы 46
3. Экспериментальная часть 50
3.1. Вещества и реагенты 50
3.2. Штаммы и плазмиды 53
3.3. Аппаратура 53
3.4. Методики проведения экспериментов 54
3.4.1. Методы работы с ДНК 54
3.4.2. Конструирование плазмид 55
3.4.3. Получение гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA и термостабильной люциферазы L. mingrelica, содержащих His6-последовательность 57
3.4.4. Изучение свойств гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA 58
3.4.5. Применение гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA в иммуноферментном анализе для детекции клеток Salmonella 60
3.4.6. Применение гибридного белка Luc-SA для детекции биотинилированной ДНК клеток E. coli 63
3.4.7. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica 65
3.4.8. Гетерогенный конкурентный иммуноанализ прогестерона с использованием биолюминесцентного метода детекции 70
4. Результаты и обсуждение 72
4.1. Получение и свойства гибридного белка люциферазы с биотинсвязывающим доменом (bccp) 72
4.1.1. Конструирование плазмиды 72
4.1.2. Свойства гибридного белка люцифераза-bccp 73
4.2. Получение и свойства гибридных белков люциферазы со стрептавидином
4.2.1. Конструирование плазмид 76
4.2.2. Получение гибридных белков люцифераза-стрептавидин 77
4.2.3. Свойства гибридных белков люцифераза-стрептавидин 78
4.3.Применение гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp в биоспецифическом анализе
4.3.1. Специфическая детекция клеток Salmonella с использованием гибридных белков Luc bccp и Luc-SA 82
4.3.2. Гибридизационный анализ ДНК с использованием гибридного белка Luc-SA 4.4. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica 96
4.4.1. Конструирование системы для эффективного BRET 96
4.4.2. Получение и свойства конъюгатов люцифераза-прогестерон 100
4.4.3. Получение и свойства конъюгатов антитело-краситель 106
4.4.4. Оптимизация условий регистрации BRET-сигнала и анализа прогестерона 111
4.4.5. Гетерогенный иммуноанализ прогестерона с использованием биолюминесцентного метода детекции 122
5. Выводы 127
6. Список литературы 129
