Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологическая роль АБК 11
1.2. Биосинтез АБК 11
1.3. Сигналинг абсцизовой кислоты 12
1.3.1. Вторичные мессенджеры 12
1.3.2. Протеинкиназы 13
1.3.3. Протеинфосфатазы 15
1.3.4. АБК-связывающие белки в сигналинге АБК 16
1.3.5. Рецепция 19
1.4. АБК и пост-транскрипционная регуляция экспрессии генов 20
1.5. Структура и функция РНК-связывающих белков (РСБ). Участие РСБ в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов 23
1.5.1. Процессинг пре-мРНК 25
1.5.1.1. Кэпирование 25
1.5.12. Полиаденилирование 26
1.5.1.3. Сплайсинг 28
1.5.1.4. Редактирование 30
1.5.5.4.1. Деаминирование 30
1.5.5.4.2. C-U редактирование 31
1.5.2. Транспорт РНК 32
1.5.3. Трансляция 34
1.5.4. Деградация 37
1.5.4.1. Деаденилирование 37
1.5.4.2. Декэпирование 39
1.5.4.3. 3’-5’ путь деградации 39
1.6. Регуляция РСБ стрессового ответа у растений 40
Глава 2. Материалы и методы исследований 44
2.1. Объект исследований и условия выращивания растений 44
2.1.1. Выращивание растений A. thaliana в стерильных условиях 44
2.1.2. Выращивание растений A. thaliana в условиях абиотических
стрессов и обработки АБК 44
2.1.3. Выращивание растений A. thaliana для проведения экспериментов по изучению экспрессии гена At4g01870 в онтогенезе и распределения мРНК и белка в различных органах 44
2.1.4. Выращивание растений A. thaliana с инактивированным вставкой Т-ДНК геном At4g01870 для отбора гомозиготных растений 45
2.1.5. Выращивание растений A. thaliana для проведения экспериментов по изучению влияния АБК на прорастание семян 45
2.1.6. Выращивание растений A. thaliana для проведения экспериментов по изучению влияния экзогенной АБК на удлинение корней 45
2.1.7. Выращивание растений A. thaliana для проведения экспериментов по изучению влияния АБК на удлинение гипокотилей 45
2.2. Методы исследований 46
2.2.1. Методы работы с ДНК 46
2.2.1.1. Выделение суммарной растительной ДНК 46
2.2.1.2. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле 46
2.2.1.3. Полимеразная цепная реакция 47
2.2.1.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 47
2.2.1.5. Бактериальные штаммы и векторы 48
2.2.1.6. Клонирование 48
2.2.1.6.1. Приготовление компетентных клеток Ca-методом .49
2.2.1.6.2. Трансформация бактерий .49
2.2.1.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli .49
2.2.2. Методы работы с РНК 50
2.2.2.1. Выделение суммарной РНК из растений A. thaliana 50
2.2.2.2. Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле 50
2.2.2.3. Обработка РНК ДНКазой и синтез кДНК 50
2.2.3. Методы работы с белками 51
2.2.3.1. Выделение суммарного белка из растительной ткани 51
2.2.3.2. Денатурирующий электрофорез белков в ПААГ 51
2.2.3.3. Нативный электрофорез белков в градиенте плотности ПААГ 51
2.2.3.4. Окрашивание ПАА-геля Coomassie R-250 52
2.2.3.5. Вестерн-блоттинг 52
2.2.3.6. Получение и очистка рекомбинантного белка и его фрагментов .52 2.2.3.7 Получение поликлональных антител .53
2.2.4. Выделение протопластов из суспензионной культуры клеток A. thaliana 53
2.2.5. Транзиентная трансформация протопластов 53
2.2.6. Флуоресцентная микроскопия 54
2.2.7. Биоинформационные методы 54
2.2.8. Статистический анализ 54
Глава 3. Результаты и их обсуждение 55
3.1. Характеристика гена At4g01870 и кодируемого им белка in silico 55
3.2. Получение экспрессионных конструкций 58
3.3. Получение и очистка рекомбинантного белка и его N-, C-концевых и центральных областей 61
3.4. Получение поликлональных антител к белку At4g01870 63
3.5. Экспрессия гена At4g01870 64
3.5.1. Динамика накопления продуктов гена At4g01870 в онтогенезе 64
3.5.2. Распределение мРНК и белка, кодируемых геном At4g01870, в различных органах A. thaliana 65
3.5.3. Суточная динамика накопления мРНК и белка, кодируемых геном At4g01870, у растений A. thaliana 66
3.5.4. Экспрессия гена At4g01870 в условиях абиотических стрессов и при действии экзогенной АБК 68
3.6. АБК-связывающие свойства белка At4g01870 71
3.7. Локализация АБК-связывающего сайта белка At4g01870 74
3.8. Предсказание третичной структуры белка At4g01870 in silico 75
3.9. Сравнительный анализ пространственных структур At4g01870 и АБК-связывающих белков - PYR1, FCA и CHLH in silico 77
3.10. Морфофизиологический анализ инсерционного мутанта по гену At4g01870 79
3.11. РНК-связывающие свойства белка At4g01870 83
3.12. Способность белка At4g01870 к образованию белковых комплексов 85
3.13. Внутриклеточная локализации белка At4g01870 88
Заключение 90
Выводы 94
Список литературы
