Введение
1. Обзор литературы
1.1.Хоуминг-эндонуклеазы 11
1.2. H-N-H-эндонуклеазы 12
1.3. Каталитический центр H-N-H-эндонуклеаз 15
1.3.1. Структура каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз 15
1.3.2. Роль иона металла в структуре активного центра H-N-H-эндонуклеаз 17
1.3.3. Единство структурной и функциональной организации каталитического центра нуклеаз суперсемейства "ррос-Ме" 18
1.3.4. Модель катализа гидролиза ДНК эндонуклеазами семейства H-N-H 20
1.4. Генетическая роль H-N-H-эндонуклеаз 22
1.5. Узнавание ДНК-субстратов хоуминг-эндонуклеазами 27
1.5.1. Специфическое узнавание последовательности ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами 27
1.5.2. Взаимодействие эндонуклеазы \-Crel с сайтом узнавания 29
1.5.3. Взаимодействие эндонуклеазы \-Ppol с сайтом узнавания 33
1.5.4. Взаимодействие эндонуклеазы l-Tevl с сайтом узнавания 35
1.5.5. Взаимодействие эндонуклеазы І-Я/wwI с сайтом узнавания 40
2. Материалы и методы
2.1.Плазмиды 44
2.2. Штаммы бактерий и бактериофагов 44
2.3. Базовые методы молекулярной биологии и биохимии 45
2.4. ДНК-субстраты 45
2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции ш vitro 46
2.6. Транскрипция in vitro 47
2.7. Синтез белка в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы 48
2.8. Анализ нуклеазной активности 48
2.9. Картирование точек разрыва ДНК 50
2.10. Экспрессия и очистка эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll 50
2.11. Картирование сайта узнавания эндонуклеазы F-ТУШ 53
2.11.1. Защита ДНК белком от воздействия ДНКазы I, гидроксильных радикалов и диметилсульфата 53
2.11.1.1. Защита от ДНКазы 1 53
2.11.1.2. Защита от гидроксильных радикалов 53
2.11.1.3. Защита от диметилсульфата 54
2.11.2. Эксперименты с использованием модифицированных ДНК-субстратов (метилированных, этилированных или с удаленным нуклеозидом) 55
2.11.3. Секвенирование ДНК-субстрата по Максаму-Гилберту (A+G) 55
2.11.4. Анализ расщепленных фрагментов ДНК 56
2.11.5. Количественная обработка результатов 56
2.12. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей 57
2.13. Олигонуклеотиды 58
3. Результаты
3.1. В области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 Escherichia coli, а также бактериофага 5 Salmonella enterica sv. Heidelberg обнаружены OPC, кодирующие предполагаемые H-N-H-эндонуклеазы 59
3.2. Гены hegA, hegB, hegC и hegD кодируют сайт-специфические эндонуклеазы 63
3.3. Выявление дополнительных сайтов гидролиза эндонуклеаз F-Tfll, F-Tflll и F-7/ЯІІ 68
3.4. Разработана схема вьщеления и очистки эндонуклеаз F-TJR и F-Tflll 71
3.5. Эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll наиболее активны при экстремальных значениях рН и температуры 72
3.6. Активность эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll стимулируется широким рядом ионов двухвалентных металлов 74
3.7. Ион Zn , по-видимому, стабилизирует структуру изучаемых нуклеаз 75
3.8. Эндонуклеаза F-7J7II специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания 76
3.8.1. Эндонуклеаза F-Tflll связывает протяженный участок ДНК 76
3.8.2. Контакты эндонуклеазы F-Tflll с остовом ДНК распределены по всему сайту узнавания 83
3.8.3. Контакты эндонуклеазы F-7J7II с основаниями расположены в двух участках сайта узнавания 84
3.8.4. Эндонуклеаза F-7J7II контактирует с основаниями сайта узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК 85
3.8.5. Контакты с остатками фосфатов остова ДНК не существенны для образования комплекса F-ТЩ-ДНК 86
Обсуждение 88
