Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Семейство Т-четные бактериофаги 8
1.1.2. Особенности структуры и развития бактериофага Т4 9
1.1.3. Явление частичного исключения генетических маркеров при скрещивании фагов Т4-типа 12
1.2. Хоминг-эндонуклеазы 14
1.2.1. Описание хоминг-эндонуклеаз 17
1.2.2. Описание различных групп хоминг-эндонуклеаз 21
1.2.3. Хоминг, как один из вариантов мобильности ДНК 28
1.2.4. Биологическая роль хоминг-эндонуклеаз 31
1.3. Хоминг-эндонуклеаз бактериофага Т4 и родственных фагов 32
1.3.1 Хоминг-эндонуклеаз бактериофага Т4, закодированных в составе интронов 32
1.3.2 Свободностоящие хоминг-эндонуклеазы бактериофага Т4, сходства и основные отличия от интрон-кодируемых эндонуклеаз 33
1.3.2.1 Сайт-специфические эндонуклеазы Mob-группы 36
1.3.3.1 Сайт-специфические эндонуклеазы Seg-группы 37
Глава 2. Методы исследования и материалы 42
2.1. Материалы 42
2.1.1. Бактериофаги и бактериальные штаммы 42
2.1.2. Вектора и полученные в ходе работы плазмиды 43
2.1.3. Олигонуклеотиды 44
2.1.4. Растворы, буферы и ростовые среды 45
2.1.5. Реактивы и материалы 47
2.2. Методы исследования 48
2.2.1. Наработка плазмид и определение концентрацииДНК 48
2.2.2. Наработка ДНК Т-четных бактериофагов 48
2.2.3. Трансформация и приготовление компетентных клеток Е. coli 48
2.2.4. Полимеразная цепная реакция 49
2.2.5. Обработка ДНК эндодезоксирибонуклеазами и лигирование ДНК-фрагментов 49
2.2.6. Получение рекомбинантных плазмид 49
2.2.7. Получение фагов T4AsegD, D2, В20й?да, DlinsZ и D2ets9 50
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 51
2.2.9. Скрининг рекомбинантных плазмид 51
2.2.10. Разделение фрагментов ДНК в электрическом поле 51
2.2.11. ДНК гибридизация по методу Саузерна 52
2.2.12. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле 54
2.2.13. Получение TEV-протеазы 54
2.2.14. Очистка TEV-протеазы 54
2.2.15. Экспрессия ОРС segD 55
2.2.16. Очистка эндонуклеазы SegD 55
2.2.17. Определение оптимальных условий работы эндонуклеазы SegD in vitro .56
2.2.18. Установление точек расщепления и границ узноваемой последовательности ДНКэндонуклеазой SegD .57
2.2.19. Анализ эндонуклеазной активности SegD на ДНК бактериофагов 58
2.2.20. Определение эндонуклеазной активности SegD в бесклеточных экстрактах E.coli, зараженных бактериофагом T4 58
2.2.21. Получение Т-четных бактериофагов и определение титра фагов .59
2.2.22. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства .60
2.2.23. Программы, использованные в работе .60
Глава 3. Результаты и обсуждение .61
3.1. Структурная организация области генов 23-24 у Т4-родственых бактериофагов .61
3.2. Очистка белка SegD .63
3.3. Исследование биохимических свойств эндонуклеазы SegD .65
3.4. Картирование сайта гидролиза эндонуклеазы SegD 71
3.5. Сайт гидролиза эндонуклеазы SegD находится на 3 - конце гена 23 .72
3.6. Исследование влияния модификации ДНК Т-четных бактериофагов на эффективность и специфичность гидролиза SegD 76
3.7. Ген segD экспрессируется в клетках E. coli, инфицированных фагом T4 79
3.8. Анализ наследования гена segD при скрещивании segD+ и segD-фагов .81
3.9. Анализ SegD-инициируемой рекомбинации в rII-локусе фага Т4 85
Заключение .87
Выводы .88
Список сокращений .89
Список литературы 90
