Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Фрагментация ДНК в естественных условиях 13
1.2. Искусственная фрагментация ДНК
1.2.1. Фрагментация ДНК под действием ферментов или химических реагентов 18
1.2.2. Физические способы фрагментации ДНК
1.2.1.1. Механическая фрагментация ДНК 21
1.2.1.2. Прочие физические способы фрагментации ДНК 24
1.2.3. Свойства молекул ДНК, влияющие на характер ее фрагментации под действием физических факторов 26
1.3. Выделение короткоцепочечных ДНК 29
1.4. Методы анализа короткоцепочечных ДНК
1.4.1. Сложности при работе с короткоцепочечными ДНК 34
1.4.2. Амплификация короткоцепочечных ДНК
1.4.2.1. Дизайн праймерных систем 39
1.4.2.2. Амплификация, опосредованная лигированием 42
1.4.3. Секвенирование короткоцепочечных ДНК 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 47
2.1. Реактивы и материалы, использованные в работе 47
2.2. Олигонуклеотиды, использованные в работе 50
2.3. Выделение ДНК 59
2.4. Подготовка ДНК-матриц 62
2.5. Амплификация ДНК 64
2.6. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот 66
2.7. Секвенирование нуклеотидных последовательностей
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Ультразвуковая фрагментация ДНК 72
3.1.1. Влияние длины молекул и динуклеотидов 5 -CG-3 на скорость ультразвуковой фрагментации ДНК 77
3.1.2. Оценка сиквенс-специфичности ультразвуковой фрагментации ДНК с помощью ПНР 81
3.2. Полимеразная цепная реакция со сближенными праймерами 90
3.2.1. Дизайн праймерных систем и оценка специфичности ПНР со сближенными праймерами 90
3.2.2. Димеризация сближенных праймеров в ПЦР 96
3.2.3. Преимущества ПЦР со сближенными праймерами 102
3.2.4. Оценка чувствительности ПНР с праймерами "встык" 108
3.2.5. Демонстрация преимуществ ПЦР с праймерами встык для амплификации разрушенной ДНК 112
Заключение 118
Выводы 122
Список цитированной литературы
