Введение
1. Обзор литературы 18
1.1. Классификация и номенклатура Hsps 18
1.2. Функции Hsps
1.2.1. Внутриклеточные функции основных групп Hsps 22
1.2.2. Происхождение и функции экзогенных Hsps 42
1.2.3. Механизмы развития болезни Альцгеймера и участие в них Hsp70 и Hsp90 48
1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ 58
1.4. Роль Hsps в адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды 79
1.4.1. Общие аспекты адаптации к неблагоприятным условиям среды на уровне клетки и организма 79
1.4.2. Роль Hsps в адаптации к гипертермии на примере Drosophila 84
1.4.3. Исследования роли Hsp70 в термальной адаптации у немодельных видов 93
1.4.4. Закономерности синтеза Hsps у видов, обитающих в контрастных температурных условиях 107
1.5. Структура и эволюция генов ТШ 107
2. Материалы и методы 121
2.1. Линии D. melanogaster 121
2.2. Штаммы E. coli 121
2.3. Ферменты рестрикции 121
2.4. Векторы 121
2.5. Антитела 122
2.6. Лабораторные животные 122
2.7. Сбор видов Diptera в естественных условиях обитания 122
2.8. Сбор видов Amphipoda 125
2.9. Получение образцов ткани верблюда Camelus dromedarius 125
2.10. Выделение лейкоцитарных фракций крови 125
2.11. Линии эукариотических клеток, условия культивирования 125
2.12. Условия теплового шока и определение термоустойчивости 126
2.13. Выделение тотальной РНК 126
2.14. Получение библиотек кДНК, ПЦР с обратной транскрипцией и RACE-анализ 126
2.15. Электрофорез РНК 127
2.16. Нозерн-гибридизация 127
2.17. Включение 35S-метионина в белки 127
2.18. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей Кумасси G-250 128
2.19. Двумерный электрофорез белков по О Фарреллу 128
2.20. Иммуноблоттинг 128
2.21. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга 129
2.22. Выделение геномной ДНК 129
2.23. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 130
2.24. Получение геномных фаговых и космидных библиотек 130
2.25. Скрининг геномных фаговых и космидных библиотек 130
2.26. Выделение ДНК бактериофага 131
2.27. Электрофорез ДНК 131
2.28. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 131
2.29. Включение радиоактивной метки в ДНК 132
2.30. Перенос и гибридизация по Саузерну 132
2.31. Выделение фрагментов ДНК из геля 132
2.32. Субклонирование фрагментов ДНК 132
2.33. Трансформация компетентных клеток 133
2.34. Выделение плазмидной ДНК 133
2.35. Секвенирование ДНК 133
2.36. Анализ последовательностей in silico 133
2.37. ПЦР и ОТ-ПЦР с анализом по конечной точке и в реальном времени 134
2.38. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка GAF D.
melanogaster 134 2.39. Получение белковых экстрактов из ядер клеток личинок D. melanogaster и S. singularior, культур клеток S2 и HEK293 135
2.40. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA) 135
2.41. Получение репортерных конструкций на основе вектора pGL4.10 1 2.42. Трансфекция и измерение интенсивности люминесценции 136
2.43. Получение плазмид для трансформации D. melanogaster 136
2.44. Р-элемент-зависимая трансформация D. melanogaster 137
2.45. Иммунопреципитация хроматина (ChIP-анализ) 137
2.46. Экспрессия рекомбинантных Hsp70 в клетках E. coli
2.47. Экспрессия рекомбинантного Hsp70 в культуре клеток Spodoptera frugiperda 138
2.48. Очистка рекомбинантного Hsp70 из молока трансгенных мышей 139
2.49. Мечение очищенного рекомбинантного Hsp70 флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647) и изотопом 125I 139
2.50. Определение субстрат-связывающей активности рекомбинантного Hsp70 139
2.51. Определение шаперонной активности рекомбинантного человеческого Hsp70 139
2.52. Действие рекомбинантного Hsp70 на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами 140
2.53. Введение рекомбинантного Hsp70 подопытным крысам и индукция эндотоксинового шока 140
2.54. Определение основных биохимических характеристик плазмы крови при введении рекомбинантного Hsp70 и ЛПС 140
2.55. Бульбэктомия мышей линии NMRI 140
2.56. Введение рекомбинантного Hsp70 подопытным мышам
2.57. Биопсия и гистологическое исследование тканей головного мозга 141
2.58. Измерение уровня синаптофизина и липофусцина в тканях головного мозга 141
2.59. Определение уровня -амилоида и эндогенного Hsp70 в мозгу бульбэктомированных мышей 141
2.60. Статистическая обработка результатов 142
3. Результаты 143
3.1. Термоустойчивость исследуемых видов Diptera и Amphipoda 143
3.2. Транскрипция генов ТШ у личинок исследуемых видов Diptera при нормальных условиях и гипертермии 148
3.3. ДНК-связывающая активность HSF при нормальных условиях и TШ у видов семейства Stratiomyidae 151
3.4. Синтез Hsp70 у различных видов Diptera при нормальной температуре и ТШ 152
3.5. Уровень мРНК и белка Hsp70 у байкальских амфипод при нормальной температуре и после ТШ 162
3.6. Структура генов hsp70 и hsp83 у видов семейства Stratiomyidae 163
3.6.1. Получение и анализ кДНК генов hsp70 видов Stratiomys 163
3.6.2. Структура кластера генов hsp70 S. singularior 163
3.6.3. Структура кластера генов hsp70 O. pardalina 168
3.6.4. Характеристики белков Hsp70 S. singularior и O. pardalina 172
3.7. Структура генов hsp70 байкальских видов Amphipoda 173
3.8. Структура генов hsp83 S. singularior и O. pardalina 175
3.9. Клонирование и анализ структуры кластера генов группы HspA1 верблюда Camelus dromedarius 181
3.10. Анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных областей генов hsp70 и hsp83 in silico 187
3.10.1. Структура промоторных областей генов hsp70
S. singularior и O. pardalina 187
3.10.2. Структура промоторов генов hsp83 Diptera 189
3.10.3. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов группы hspA1 верблюда и других видов млекопитающих 190
3.11. Функциональный анализ активности промоторов генов ТШ разных видов двукрылых и млекопитающих 192
3.11.1. Сравнение активности промоторов hsp70 и hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2 192
3.11.2. Анализ связывания факторов транскрипции с промоторными областями генов hsp70 и hsp83 S. singularior in
vitro 194
3.11.3. Влияние вставки GAGA-сайтов на активность промотора гена hsp70S3 в клетках S2 197
3.11.4. Определение активности различных вариантов промоторов hsp70 S. singularior в клетках D. melanogaster in vivo 198
3.11.5. Анализ взаимодействия GAF с промоторными областями генов hsp70Aa и hsp70S3 у трансгенных линий in vivo 202
3.11.6. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культурах клеток человека 203
3.12. Изменения стабильности Hsp70 S. singularior при экспрессии в клетках D. melanogaster 208
3.13. Изучение потенциала применения рекомбинантного Hsp70 в качестве иммуномодулятора и нейропротектора 210
3.13.1. Выделение и анализ активности различных форм рекомбинантного Hsp70 210
3.13.2. Влияние экзогенного рекомбинантного Hsp70 на выживаемость лабораторных животных в эксперименте по моделированию эндотоксинового шока 214
3.13.3. Влияние экзогенного Hsp70 на значения биохимических показателей крови при моделировании эндотоксиного шока 217
3.13.4. Изменения уровней эндогенного Hsp70, -амилоида и пространственной памяти у бульбэктомированных мышей 217
3.13.5. Регистрация флуоресцентно и радиоактивно меченого экзогенного Hsp70 в мозгу после интраназального введения 219
3.13.6. Экзогенный Hsp70 при интраназальном введении снижает аккумуляцию A в мозгу бульбэктомированных и трансгенных (5XFAD) мышей 221
3.13.7. Интраназальное введение рекомбинантного Hsp70 приводит к нормализации уровня синаптофизина и липофусцина в мозгу старых животных 221
4. Обсуждение результатов 224
4.1. Характер экспрессии генов hsp70 у видов, относящихся к различным семействам отряда Diptera, обитающих в контрастныхтемпературных условиях 224
4.2. Эволюция кластера генов hsp70 и hsp83 233
4.3. Структурно-функциональная специфичность промоторов генов hsp70 и hsp83 разных видов Diptera и млекопитающих 238
4.4. Иммуномодулирующее действие экзогенного Hsp70 244
4.5. Экзогенный Hsp70 как нейропротектор 247
5. Выводы 251
Благодарности 253
Список цитируемой литературы
