Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Убиквитин-протеасомная система деградации белков (УПС) 13
1.1.1 Структура протеасомы 14
1.1.2 Убиквитинирование белков 16
1.1.3 Заболевания, ассоциированные с нарушением функции УПС 18
1.2 RING-домен содержащая убиквитинлигаза Pirh2 24
1.2.1 Структура белка Pirh2 24
1.2.2 Изоформы белка Pirh2 25
1.2.3 Регуляция активности белка Pirh2 26
1.3 Белки-мишени убиквитинлигазы Pirh2 28
1.3.1 Семейство транскрипционных факторов р53 28
1.3.2 Ингибитор циклин-зависимой киназы 1B – p27kip1 33
1.3.3 Транскрипционный фактор с-Myc 34
1.3.4 ДНК-полимераза (Pol) 34
1.3.5 Серин/треониновая протеинкиназа Chk2 35
1.3.6 Деацетилаза гистонов HDAC1 36
1.4 Участие убиквитинлигазы Pirh2 в канцерогенезе 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1 Клеточные культуры 41
2.1.1 Клеточные линии, использованные в работе 41
2.1.2 Условия культивирования 41
2.1.3 Обработка клеток химическими агентами 42
2.1.4 Трансфекция клеток 42
2.1.5 Получение стабильных клеточных линий 43
2.2 Генетические конструкции и молекулярное клонирование 44
2.3 Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 46
2.4 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 48
2.5 GST-пулдаун 49
2.6 Масс-спектрометрия 50
2.7 Ко-иммунопреципитация 50
2.8 Убиквитинирование in vivo 51
2.9 Разделение белков в ПААГ и вестерн-блот
2.10 Мониторинг пролиферации и миграции клеток в режиме реального времени 54
2.11 Тест на зарастание царапины 54
2.12 МТТ-тест 55
ГЛАВА 3. Результаты 56
3.1 Транскрипционный фактор р63 активирует экспрессию убиквитинлигазы Рirh2 56
3.1.1 P53 активирует экспрессию Pirh2 в клетках линии рака толстой кишки человека HCT116 56
3.1.2 Транскрипционный фактор p63 активирует экспрессию Pirh2 на уровне белка 57
3.1.3 Транскрипционный фактор p63 активирует экспрессию Pirh2 на уровне мРНК 59
3.2 Определение новых белков-интерактантов убиквитинлигазы Pirh2 60
3.2.1 Масс-спектрометрический анализ интерактома Pirh2 60
3.2.2 Белок Pirh2 физически взаимодействует с гистоном H2A.Z и убиквитинирует его 81
3.2.3 Белок Pirh2 – убиквитинлигаза белка Elavl1/HuR, направляющая его
на деградацию 85
3.3 Белок Рirh2 усиливает канцерогенные свойства клеток немелкоклеточной
карциномы легкого Н1299 89
3.3.1 Влияние временной трансфекции Pirh2 на пролиферативный потенциал клеток Н1299 90
3.3.2 Получение стабильных клеточных линий с эктопической экспрессией Pirh2 и shRNA Pirh2 на основе линии H1299 92
3.3.3 Влияние Pirh2 на пролиферативный потенциал изогенных линий H1299 с различным статусом экспрессии Pirh2 93
3.3.4 Pirh2 усиливает миграционный потенциал клеток Н1299 94
3.3.5 Pirh2 повышает устойчивость клеток Н1299 к доксорубицину 99
3.3.6 Pirh2 повышает уровень экспрессии онкогенного белка с-Myc в клетках H1299 101
ГЛАВА 4. Обсуждение 104
4.1 Убиквитинлигаза Рirh2 – новая транскрипционная мишень белка p63 104
4.2 Pirh2 участвует в регуляции неканонического гистона H2A.Z 107
4.3 РНК-связывающий белок Elav1/HuR – новая мишень убиквитинлигазы Pirh2 111
4.4 Pirh2 усиливает туморогенный потенциал клеток H1299 117
Основные выводы 121
Список литературы
