Введение
1.Обзор литературы 7
1.1. Пероксид водорода в живых клетках 7
1.2. Детекция активных форм кислорода in vivo 11
1.3. Структура и биохимические свойства флуоресцентных белков
1.3.1. Структура флуоресцентных белков 13
1.3.2. Хромофор 15
1.3.3. Яркость флуоресцентных белков 16
1.3.4. Фотостабильность флуоресцентных белков 17
1.3.5. рН-стабильность флуоресцентных белков и их производных 17
1.3.6. Красные DsRed-подобные флуоресцентные белки 18
1.4. Генетически кодируемые биосенсоры 19
1.4.1. Первые флуоресцентные сенсоры на основе пермутированных флуоресцентных белков 1.4.2.Транскрипционный фактор Escherichia coli OxyR 22
1.4.3. Генетически кодируемый высокоспецифичный сенсор для детекции пероксида водорода HyPer 23
1.5. Методы стимуляции нейронных сетей 27
1.5.1.Хемогенетика 27
1.5.2. Оптогенетика 29
1.5.3. Термогенетика 37
Цели и задачи 44
2.Материалы и методы 46
2.1 Оборудование 46
2.2. Материалы 46
2.2.1. ДНК-Вектора 46
2.2.2. Реактивы и расходные материалы для клонирования 46
2.2.3. Программное обеспечение 48
2.3. Молекулярно-биологические методы 49
2.3.1. Амплификация фрагментов ДНК 49
2.3.2. Электрофорез в агарозном геле 49
2.3.3. Выделение ДНК из геля 50
2.3.4. Рестрикция 50
2.3.5. Переосаждение ДНК этанолом 50
2.3.6. Лигирование 50
2.3.7. Выделение плазмидной ДНК 51
2.4 Работа с бактериальными клетками 51
2.4.1. Трансформация бактериальных клеток 51
2.4.2. Скрининг колоний бактериальных колоний при помощи опрыскивания раствором пероксида водорода 52
2.4.3. Анализ суспензий бактериальных клеток с помощью флуоресцентного спектрофлуориметра Varian Cary Eclipse 52
2.4.4. Отбор оптимальных клонов из библиотек 52
2.5. Работа с выделенным белком 53
2.5.1. Выделение белка из культуры клеток E.coli 53
2.5.2. Анализ спектральных характеристик белка in vitro 53
2.5.3. Анализ рН-чувствительности выделенного белка 54
2.6. Работа с эукариотическими культурами клеток 54
2.6.1. Культивирование и трансфекция клеточных линий HeLa и HEK293 54
2.6.2. Выделение и трансфекция первичной эмбриональной культуры кортикальных нейронов 55
2.6.3. Трансфекция клеток
2.7. Разведение и трансфекция Danio rerio 56
2.8. Флуоресцентная микроскопия 57
2.8.1 Микроскопия клеточных культур 57
2.8.2. Физиологическая стимуляция клеток HeLa Kyoto и НЕК293 57
2.8.3. Термогенетическая активация и термометрия клеточных культур 58
2.8.4. Химическая и тепловая стимуляция клеток НЕК293 60
2.8.5. Определение кинетических параметров работы сенсоров 61
2.8.6 Иммунофлуоресцентное окрашивание 61
2.9. Электрофизиологическая регистрация активности нервных клеток 62
2.10. Стимуляция поведения избегания у личинок Danio rerio 62
2.11. Анализ данных и статистика 64
3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Красный генетически-кодируемый сенсор для детекции пероксида водорода 65
3.1.1. Создание HyPerRed 66
3.1.2. Характеристика HyPerRed 67
3.1.3. Изучение HyPerRed в культуре эукариотических клеток 71
3.1.4. HyPerRed детектирует низкие концентрации H2O2 , продуцируемые клетками при стимуляции ростовым фактором 72
3.1.5. Изучение динамики H2O2 и GSH/GSSG в различных клеточных компартментах на уровне одной клетки 74
3.2. Термогенетика 79
3.2.1 Выбор флуоресцентной метки для термоактивируемых каналов TRPA1 81
3.2.2. Тестирование TRPA1 в культуре эукариотических клеток НЕК293 84
3.2.3. Выбор температурных условий экспрессии TRPA1 85
3.2.4. Выбор длины волны активирующего света 87
3.2.5. Определение параметров работы TRPA1 в клетках НЕК293 при активации ИК излучением 89
3.2.6. Определение кинетических характеристик работы термоактивируемых каналов TRPA1 91
3.2.7.Термогенетическая активация нейронов мыши в культуре 93
3.2.8. Термогенетическая стимуляция личинок Danio rerio in vivo 104
выводы 111
заключение 112
список сокращений 114
список литературы 117
Приложение 1 133
