Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. p21-Активируемые киназы: классификация, строение и механизмы активации 11
2.2. Роль p21-активируемых киназ в росте и распространении злокачественных опухолей 15
2.2.1. Регуляция клеточной пролиферации и апоптоза 15
2.2.2. Регуляция клеточной миграции и инвазии 18
2.3. Ингибиторы p21-активируемых киназ I группы (PAK1/2/3) и их использование в доклинических испытаниях 20
2.3.1. АТФ-конкурентные ингибиторы p21-активируемых киназ 20
2.3.2. Аллостерические ингибиторы p21-активируемых киназ 25
2.4. Этиология и молекулярные механизмы развития злокачественных опухолей оболочек периферических нервов (MPNST) 28
2.4.1. Опухоли оболочек периферических нервов при нейрофиброматозе I типа 28
2.4.2. NF1 – классический онкосупрессорный ген 29
2.4.3. Нейрофибромин и его роль в Ras-опосредованной сигнальной трансдукции 30
2.4.4. Молекулярная генетика опухолей оболочек периферических нервов 32
2.5. Современные подходы к терапии MPNST. Адресная терапия MPNST 37
2.5.1. Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ 37
2.5.2. Ингибиторы Ras 41
2.5.3. Ингибиторы каскадов MAPK/ERK и PI3K 42
2.5.4. Ингибиторы каскада Wnt -катенин 43
2.5.5. Нифедипин и кантаридин – потенциальные агенты для терапии MPNST 43
2.6. Роль р21-активируемых киназ в патогенезе опухолей оболочек периферических нервов 45
3. Материалы и методы исследования 49
3.1. Оборудование и материалы 49
3.2. Буферные растворы 52
3.3. Линии эукариотических клеток 52
3.4. Лабораторные животные 53
3.5. Тканевые микроматрицы 53
3.6. Методы 54
3.6.1. Культивирование клеточных линий 54
3.6.2. Приготовление белковых лизатов 54
3.6.3. Иммуноблоттинг 54
3.6.4. Ретровирусная трансдукция 55
3.6.5. Трансфекция малой интерферирующей РНК 56
3.6.6. Построение кривых роста 56
3.6.7. Анализ жизнеспособности клеток in vitro 57
3.6.8. Анализ клеточной инвазии 57
3.6.9. Исследование противоопухолевой активности Frax1036 и PD0325901 в модели подкожных ксенографтных MPNST 58
3.6.10. Исследование противоопухолевой активности Frax1036 и PD0325901 в модели экспериментальных лёгочных метастазов MPNST 59
3.6.11. Биолюминесцентная визуализация метастазов 59
3.6.12. Подготовка образцов тканей для гистологиских исследований 60
3.6.13. Иммуногистохимическое исследование 60
3.6.14. Построение кривых доза/эффект, расчёт полумаксимальной эффективной концентрации (IC50) и комбинационного индекса (CI) 62
3.6.15. Статистическая обработка данных 62
4. Результаты и обсуждение 63
4.1. Оценка активности PAK1/2/3 в злокачественных опухолях оболочек периферических нервов человека 63
4.1.1. Измерение уровня фосфо-PAK1/2/3 [S144/S141/S139] в биоптатах MPNST человека 63
4.1.2. Измерение уровней белков и фосфо-белков PAK1/2/3 в клеточных линиях MPNST 66
4.2. Изучение роли PAK1/2/3 в регуляции пролиферативной и двигательной активности клеток MPNST 67
4.2.1. Ингибирование каталитической активности PAK1/2/3 67
4.2.2. Влияние выключения PAK1/2/3 на рост и выживаемость клеток MPNST 69
4.2.3. Влияние выключения PAK1/2/3 на клеточную инвазию MPNST 75
4.3. Изучение роли PAK1/2/3 во внутриклеточной сигнализации MPNST 78
4.4. Индивидуальное и сочетанное воздействие ингибиторов PAK1/2/3 (Frax1036) и MEK1/2 (PD0325901) на рост и распространение MPNST 86
4.4.1. Синергическое воздействие Frax1036 и PD0325901 на клетки MPNST in vitro 86
4.4.2. Влияние Frax1036 и PD0325901 на рост подкожных ксенографтных MPNST 88
4.4.3. Влияние Frax1036 и PD0325901 на формирование и рост экспериментальных лёгочных метастазов MPNST 94
6. Благодарности 101
7. Список сокращений 102
8. Список литературы 106
