Введение
Глава1. Обзор литературы 8
1.1. Трансляция и структура рибосомы 8
1.2. Конформационная подвижность рибосомы 13
1.3. Конформационная подвижность рибосомы в ходе элонгации трансляции. 19
1.4. Терминация и рециклинг. 35
1.5. Деацилированная тРНК в Е-сайте . 44
1.6. Заключение. 49
Глава2. Материалы и методы 50
2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 50
2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 50
2.3. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе 50
2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК 50
2.5. Трансформация E. coli плазмидной ДНК 51
2.6. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 52
2.7. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автоматической системы Applied Biosystems ABI 310 52
2.8. АДФ-рибозилирование eEF2 52
2.9. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ 53
2.10. Электрофорез белков в нативном 10% ПААГ 53
2.11. Получение посттранлокационных комплексов рибосом 53
2.11.1. Получение мРНК 53
2.11.2. Выделение рибосом 53
2.11.3. Выделение факторов трансляции (нативных и рекомбинантных) 54
2.11.4. Аминоацилирование тРНК 54
2.11.5. Сборка ПОСТ комплекса 55
2.12. Проверка ПОСТ комплексов с помощью тоу-принт анализа 55
2.13. Тоу-принт анализ ПОСТ комплексов в присутствии различных лигандов 56
2.14. Анализ гидролиза пептидил-тРНК 56
2.15. Трансляция in vitro в лизате ретикулоцитов кролика 56
2.16. RelE анализ 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Деацилированная тРНК стабилизирует эукариотические терминационные комплексы 57
3.2. Детерминанты, определяющие стабилизирующую активность деацилированной тРНК, расположены в её акцепторной ветви 64
3.3. Механизм стабилизации стабилизации eRF1 деацилированной тРНК и её роль в регуляции трансляции эукариот 67
3.4. Обратная транслокация эукариотических рибосом происходит в присутствии eEF2 и деацилированной тРНК 69
3.5. Условия, необходимые для обратной трналокации 75
3.6. АДФ-рибозилирование eEF2 ингибирует обратную транслокацию 78
3.7. Механизм обратной транслокации эукариот и её роль в понимании работы рибосомы 80
Заключение: роль конформационной подвижности рибосомы в регуляции трансляции эукариот 83
Выводы 85
Список цитируемой литературы 86
