ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................... 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 12
1.1. Роль доменной структуры в функционировании белков .................................................. 12
1.2. Общая характеристика бактериальных токсинов.............................................................. 19
1.3. Порообразующие токсины, имеющие структуру типа β-баррель ................................... 22
Классификация порообразующих токсинов .................................................................. 22
Взаимодействие β-порообразующих токсинов с мембранами клеток-мишеней ....... 27
Механизм порообразования β-пороформирующих токсинов ...................................... 29
Особенности пространственной структуры некоторых β-пороформирующих
токсинов............................................................................................................................................ 31
1.4. Характеристика токсинов Bacillus cereus........................................................................... 35
1.5. Гемолизин II Bacillus cereus ................................................................................................ 38
1.6. С-терминальный домен гемолизина II Bacillus cereus ...................................................... 39
Функционирование С-терминальных доменов белков ................................................. 39
С-терминальный домен гемолизина II Bacillus cereus .................................................. 41
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................. 45
2.1. Иммунизация мышей BALB/c рекомбинантным препаратом HlyIICTD Bacillus cereus ..
................................................................................................................................................ 45
Иммунизация HlyIICTD в полном адъюванте Фрейнда ............................................... 45
Иммунизация HlyIICTD в неполном адъюванте Фрейнда ........................................... 46
Бустерная иммунизация HlyIICTD в фосфатно-солевом буфере................................. 46
2.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ ..................................................... 46
2.3. Получение моноклональных антител против HlyIICTD В. cereus ................................. 47
Приготовление фидерного слоя макрофагов мыши ...................................................... 47
Культивирование клеток миеломы SP2/0 ....................................................................... 47
Замораживание клеток ..................................................................................................... 48
Извлечение иммунных спленоцитов мыши ................................................................... 48
Слияние иммунных и миеломных клеток с помощью полиэтиленгликоля ................ 48
Культивирование первичных гибридом ......................................................................... 49
Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений .................................. 49
Наработка моноклональных антител против HlyIICTD Bacillus cereus в
культуральных жидкостях .............................................................................................................. 50
Очистка моноклональных антител аффинной хроматографией на белок-А-сефарозе ..
............................................................................................................................................ 50
Определение концентрации иммуноглобулинов ........................................................... 50
Определение типов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов ................................. 51
2.4. Электрофоретический анализ белковых препаратов ........................................................ 51
2.5. Иммуноблоттинг ................................................................................................................... 52
2.6. Изучение взаимодействия HlyIICTD с эритроцитами ...................................................... 52
Подготовка эритроцитов .................................................................................................. 52
Биотинилирование HlyIICTD и моноклональных антител ........................................... 53
Взаимодействие HlyIICTD с эритроцитами в составе иммунных комплексов .......... 53
Специфичность взаимодействия HlyIICTD с эритроцитами ........................................ 54
Определение константы аффинности взаимодействия HlyIICTD-bio с эритроцитами
в координатах Скэтчерда ................................................................................................................ 54
Наработка липосом ........................................................................................................... 55
Иммуноблотинг HlyIICTD в присутствии клеточных мембран................................... 55
Возможное влияние HlyIIC-20 на взаимодействие HlyIICTD-bio с эритроцитами ... 55
Олигомеризация HlyII в присутствии эритроцитов и моноклонального антитела
HlyIIC-20 .......................................................................................................................................... 56
2.7. Эпитопное картирование моноклональных антител к HlyIICTD .................................... 56
Фаговый дисплей .............................................................................................................. 56
Отбор бактериофагов, взаимодействующих с исследуемыми антителами ................ 56
Выращивание бактериофагов в полужидком агаре ....................................................... 57
Выделение бактериофагов ............................................................................................... 57
Выделение ДНК фагов ..................................................................................................... 58
Определение нуклеотидных последовательностей ДНК фаговых клонов ................. 59
2.8. Изучение токсин-нейтрализующего действия моноклональных антител ..................... 59
Определение гемолитической активности HlyII in vitro ............................................... 59
Скрининг панели моноклональных антител на предмет подавления гемолитической
активности HlyII .............................................................................................................................. 59
Подавление гемолитической активности HlyII моноклональным антителом
HlyIIC-20 .......................................................................................................................................... 60
Добавление HlyIIC-20 к эритроцитам после гемолизина ............................................. 60
Определение константы аффинности взаимодействия HlyIIC-20 с HlyIICTD, HlyII
ATCC 14579T и HlyII B771 ............................................................................................................. 60
Подавление токсического действия HlyII ATCC 14579T in vivo моноклональным
антителом HlyIIC-20 ........................................................................................................................ 61
2.9. Действие HlyIICTD на клетки иммунной системы ........................................................... 61
Культивирование клеток .................................................................................................. 61
Проточная цитометрия .................................................................................................... 62
Определение константы аффинности взаимодействия HlyIICTD с иммунными
клетками в координатах Скэтчарда ............................................................................................... 63
2.10. Статистическая обработка результатов экспериментов ................................................... 63
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ..................................................................... 65
3.1. Рекомбинантные белки, используемые в исследовании .................................................. 65
Характеристика аминокислотной последовательности рекомбинантного HlyIICTD 65
3.2. Получение моноклональных антител к HlyIICTD Bacillus cereus ................................... 66
Получение стабильных гибридомных клонов-продуцентов моноклональных антител
к HlyIICTD Bacillus cereus .............................................................................................................. 66
Наработка моноклональных антител в культуральных жидкостях ............................. 69
Изотипирование моноклональных антител к HlyIICTD ............................................... 69
Очистка моноклональных антител .................................................................................. 70
Исследование взаимодействия моноклональных антител против HlyIICTD и HlyII
методом иммуноблоттинга ............................................................................................................. 72
Участки рекомбинантного HlyIICTD, связывающиеся с моноклональными
антителами ....................................................................................................................................... 74
3.3. Локализация эпитопа, узнаваемого моноклональным антителом HlyIIС-15 ................. 76
3.4. HlyIIС-20 штамм-специфически подавляет гемолиз эритроцитов, вызванный HlyII
Bacillus cereus ................................................................................................................................... 79
Скрининг панели полученных моноклональных антител на предмет подавления
гемолитической активности HlyII Bacillus cereus ........................................................................ 79
Токсин-нейтрализующее действие моноклонального антитела HlyIIС-20 в
экспериментах in vitro ..................................................................................................................... 79
Определение константы аффинности взаимодействия HlyIIС-20 с рекомбинантными
препаратами гемолизина ................................................................................................................. 80
Влияние аминокислотного остатка 324 (Leu/Pro) в первичной последовательности
HlyII на способность HlyIIC-20 подавлять гемолитическую активность токсина ................... 82
Эффективность токсин-нейтрализующего действия моноклонального антитела
HlyIIС-20 in vivo ............................................................................................................................... 84
3.5. Изучение взаимодействия HlyIICTD с клеточными мембранами ................................... 85
Взаимодействие HlyIICTD с эритроцитами в составе иммунных комплексов .......... 85
Количественные характеристики взаимодействия HlyIICTD с мембранами
эритроцитов ...................................................................................................................................... 88
Расположение эпитопа HlyIIC-20 на поверхности С-терминального домена ............ 91
Олигомеризация HlyIICTD в присутствии мембран клеток-мишеней ........................ 91
Зависимость олигомеризации HlyII от присутствия HlyIIC-20 .................................... 93
3.6. Изучение действия HlyIICTD на клетки иммунной системы .......................................... 94
Определение действия HlyIICTD на клетки иммунной системы ................................ 95
Проточный цитометрический анализ влияния HlyIICTD на культивируемые клетки
Jurkat ............................................................................................................................................ 97
Определение констант аффинности взаимодействия HlyIICTD с клетками иммунной
системы .......................................................................................................................................... 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................... 104
ВЫВОДЫ .............................................................................................................................. 106
БЛАГОДАРНОСТИ ............................................................................................................. 107
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ....................................... 108
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ .................................................................................................. 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................... 113
