Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Введение в обзор литературы 10
1.2 Иммунотерапия 12
1.3 Генная терапия 15
1.4 Ингибирование работы теломеразы 16
1.4.1 Методы измерения теломеразной активности 18
1.4.1.1 ТРАП анализ 18
1.4.1.2 Устранение ингибирования ПЦР 24
1.4.1.3 In vivo ТРАП 25
1.4.2 Низкомолекулярные вещества и Иметелстат 26
1.5 Ингибирование биогенеза теломеразы 32
1.5.1 Ингибирование транскрипции hTERT 32
1.5.2 Ингибирование пострансляционной модификации hTERT 35
1.5.3 Уменьшение доступности теломер для теломеразы 36
1.5.4 Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразы 43
1.5.4.1 Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНК hTERT 45
1.5.4.2 Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы на hTR 47
1.5.4.3 Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборку теломеразы 48
1.6 Заключение 48
2 Результаты и обсуждение 50
2.1 Разработка метода детекции теломеразной активности 50
2.1.1 Очистка теломеразного экстракта 50
2.1.2 Устранение ингибирования ПЦР 56
2.1.3 Проверка метода на низкомолекулярных G4-квадруплекс лигандах 61
2.1.4 Ингибирование теломеразы новым металлорганическим соединением, содержащим медь 63
2.1.5 Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислота 66
2.2 Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы 71
2.2.1 Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов 71
2.2.2 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro 76
2.2.3 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo 79
2.2.3.1 Проверка ингибирования ПЦР для in vivo ТРАП метода 81
2.2.3.2 Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточых линиях и защита 5 -конца 83
2.2.3.3 Длина и расположение линкера 84
2.2.3.4 Специфичность химерных олигонуклеотидов 85
2.2.3.5 Токсичность химерных олигонуклеотидов 87
2.2.3.6 Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствий химерных олигонуклеотидов 87
2.2.3.7. Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерных олигонуклеотидов в условиях in vivo 89
2.3 Заключение 93
3 Материалы и методы
3.1 Реактивы и биопрепараты 95
3.2 Получение S100 экстракта 100
3.3 Проверка деградации олигонуклеотида в S100 100
3.4 ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический» ТРАП) 100
3.5 Клонирование 101
3.5.1 Получение конструкций для рекомбинантной экспрессии теломеразы101
3.5.2 ПЦР 102
3.5.3 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 103
3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 103
3.5.5 Приготовление векторов и вставок 104
3.5.6 Приготовление компетентных клеток E. coli 105
3.5.7 Трансформация компетентных клеток E. coli 105
3.5.8 Выделение плазмидной ДНК для клонирования 106
3.6 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клетки106
3.7 Трансфекция плазмид в эукариотические клетки для анализа и обработка вальпроевой кислотой (ВПА) 108
3.8 Экспрессия и очистка теломеразы 109
3.9 Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП) 110
3.10 Прямой метод измерения теломеразной активности 111
3.111 Введение радиоактивной метки на 5 -конец олигонуклеотида 15bpLC112
3.12 Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получение клеточного экстракта 112
3.13 In vivo RQ-ТРАП 113
3.14 Проверка сборки теломеразы 113
3.15 Определение количества hTR с помощью метода обратной транскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР) 114
3.16 Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипции 115
3.17 Определение уровни hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР 115
3.18 МТТ анализ цитотоксичности олигонуклеотидов 116
4 вывОды 117
5 Список литературы
